大豆疫霉组蛋白乙酰转移本科相关基因PsGCN5的克隆与功能分析-微生物学专业论文.docx

创性声明 的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 赔了文中特别细以标注和致甜的地方外.论文中不包含其他人已 也不包含为蔬得安瞰农业大学或其它敏育机构的学位或证书 与我-罔工作的同志对本研究所傲的任何贡献均己在论文中 ft 了明 不了甜意. 研究生签名 I í弘乡 间z 例5年，月 J 日 关于论文使用授权的说明 完全了解安撞农业大学有关保留、使用学位论文的螺定，即:学枝育权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文披查阅和借阅，可以来用自印、缩印或扫描 制手段保存、汇编学位论文.同意安般农业大学可以用不同方式在不同媒体上 传播学位论文的全部或部分内容. (必威体育官网网址的学位论文在解密后应遵守此协议} 研究生签名 E H阳E tLρω乒q乒A刻占品渴6 r 时间: ，-，异 i月 4 日 时间: .2 / 年 4月 4 日 摘 要 大豆疫霉（Phytophthora sojae）是大豆生产中具有毁灭性的植物病原菌之一，每 年导致全球大豆生产的严重减产。近几年随着利用 RNA 干扰技术（RNAi）在大豆疫 霉的转化体系的逐渐成熟和大豆疫霉全基因组测序的完成，大豆疫霉已经成为了研究 卵菌中相关功能基因的模式菌株。 组蛋白乙酰基转移酶（Histone acetyltransferase, HATs )在生物体中具有重要的作 用，通过与组蛋白去乙酰基酶(Histone Deacetylase, HDAC)的相互作用实现了生物体内 基因组整体水平的调控。HATs 和 HDAC 主要通过对组蛋白中 H3、H4 核心组蛋白中 Lys 残基的乙酰化和去乙酰化，实现调控不同功能基因的表达。目前对 HATs 研究较 多的为 GCN5 基因，它是 HATs 家族中具有代表性的一种调控基因。在疫霉属中， GCN5 编码的氨基酸残基具有高度的同源性，特别是在编码的蛋白结构域和组蛋白乙 酰赖氨酸残基结合位点在内的 345 个氨基酸同源性在 97%以上，但是 GCN5 编码的氨 基酸序列在不同物种之间却具有明显的差异性。 通过对大豆疫霉无性生活史阶段以及侵染阶段中 PsGCN5 的 qRT-PCR 分析表明， PsGCN5 在无性生活史各个时期相对于菌丝阶段表达量均处于下调状态，而在侵染阶 段后期有一定程度的上调，在侵染时间为 12h 时，其表达量具有明显的上调变化，约 为菌丝阶段的 2.8 倍，说明在大豆疫霉侵染阶段后期起到正调控作用。 本实验通过扩增大豆疫霉中 PsGCN5 氨基酸残基的保守编码基因序列，构建 PsGCN5 沉默表达载体，利用 PEG 介导的大豆疫霉转化实验获得该基因的沉默突变体 并命名为 T37，T66，T68，对该菌株提取 RNA 并利用 qRT-PCR 验证得出，通过筛选 的沉默突变体具有良好的沉默抑制效果。 在利用已获得的沉默突变体进行表型分析结果中得出，在 10% V8 培养基中培养 条件下，沉默突变体的生长情况无明显差异变化，且其游动孢子的形成和萌发率以及 卵孢子的形成也未发生变化。在含有 5mM H2O2、0.01% SDS 和 0.7M NaCl 的 10% V8 培养基中培养条件下，沉默突变体的生长均受到明显的抑制。在对大豆寄主进行活体 以及叶片离体侵染实验结果分析得出，该基因的沉默突变体的致病性具有明显的降 低 。 关键词：大豆疫霉，RNAi，组蛋白乙酰转移酶，PsGCN5,表型分析 Abstract The plant pathogen Phytophthora sojae is one of the most destructive diseases that could cause severe loss in soybeanl production. In recent years,with the improvement of Phytophthora sojae system and Phytophthora sojae genome sequencing project, Phytophthora sojae has become the model strain for people to analyse the oomycete gene,the RNAi has become a commonly used and effective method in Phytophthora sojae functional gene analysis. Histone acetyltransferase ( HATs ) is the important essential of organisms. It could control the overall level of organ