代谢工程方法改造大肠杆菌生产聚3-羟基丁酸酯-生物化工专业论文.docx

万方数据 万方数据 摘 要 聚 3-羟基丁酸酯（PHB）具有生物可降解性和生物相容性等性能，在医药、 食品和农业等领域具有广阔的应用前景。本文研究考查了有氧呼吸链对于 PHB 积累的影响，构建了一系列生产 PHB 的菌株；通过引入编码 Bacillus subtilis 的 木糖异构酶基因 xylA、木酮糖激酶基因 xylB 和木糖运输蛋白基因 araE，使工程 菌株能够同时利用葡萄糖和木糖代谢合成 PHB；通过引入木聚糖水解质粒，使 工程菌株能够利用木聚糖进行代谢合成 PHB，并进一步考察了过表达转醛酶基 因 talA 对利用木聚糖积累 PHB 的影响。得到的主要结果如下： 首先，考查了有氧呼吸链对于 PHB 积累的影响。采用单基因敲除和组合敲 除的策略，敲除 Escherichia coli JM109 有氧呼吸链中低效率的呼吸链，包括编码 细胞色素 bd-I 氧化酶、细胞色素 bd-I 氧化酶和 NDH-II 脱氢酶的三个基因，分别 为 cydB、appB 和 ndh。其中表现优异的三株菌 LJ02（ΔappB）、LJ03（Δndh） 和 LJ23（ΔappBΔndh）利用 20 g/L 的葡萄糖分别积累了 4.53 g/L、6.16 g/L 和 4.61 g/L PHB，利用 20 g/L 的木糖分别积累了 2.78 g/L、 3.50 g/L 和 1.82 g/L PHB。其中 LJ03 利用葡萄糖合成 PHB 的得率为 0.32 g (g glucose)-1，是理论得率的 66.67%。 接着对 LJ03 进行 5-L 发酵罐的实验，发酵 28 h，积累了 28.23 g/L PHB，得率达 到了 0.25 g (g glucose)-1。说明敲除低效率的呼吸链细胞色素 bd-I 氧化酶和 NDH-II 脱氢酶对于 PHB 的积累是有利的。 之后通过异源引入编码 Bacillus subtilis 的木糖异构酶基因 xylA、木酮糖激 酶基因 xylB 和木糖运输蛋白基因 araE，在 10 g/L 葡萄糖和 5 g/L 木糖的培养基 中，LJ02、LJ03 和 LJ23 能够同时利用葡萄糖和木糖，并且分别积累了 3.87 g/L、 4.1 g/L 和 4.15 g/L PHB。说明解除了 E. coli 葡萄糖阻遏效应。 最后通过引入木聚糖水解质粒，LJ02、LJ03 和 LJ23 利用 5 g/L 木聚糖和 10 g/L 木糖，分别积累了 2.08 g/L、2.02 g/L 和 2.29 g/L PHB。为了提高木糖代谢速 率，本研究过表达了转醛酶基因 talA，发现过表达 talA 基因对 LJ02 和 LJ23 利用 木糖积累 PHB 是有利的，对 LJ03 利用木糖积累 PHB 反而有不利影响。但是过 表达 talA 基因对 LJ02、LJ03 和 LJ23 利用木聚糖积累 PHB 没有提升作用，反而 会在一定程度上影响木聚糖的利用。研究结果表明，通过一系列代谢工程改造的 E. coli JM109 具有良好的 PHB 合成能力和应用潜力。 关键词：大肠杆菌，聚 3-羟基丁酸酯，代谢工程，葡萄糖，木糖，木聚糖 ABSTRACT As the best characterized member of the PHA, poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) is a polyester of 3-hydroxybutyrate. As biodegradable and biocompatible materials with diverse properties, PHB has drawn industrial attentions such as pharmaceuticals industry for their potential applications in many fields. A series of engineered E.coli JM109 mutants were constructed that could efficiently produce PHB in this study. The respiratory chains of E.coli were firstly analyzed. Then we solved the problem of simultaneous fermentation problem between the glucose and xylose by heterologous expression of xylose isomerase gene (xylA), xylulokinase gene (xylB) an