成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马 内源性神经发生研究 中文摘要 目的： 第一部分 成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生 探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后大脑皮质内源性的神 经发生及其影响因素。 方法： Ⅰ、体内实验 1. SD 大鼠分为假手术（SHAM）组和 TBI 组，SHAM 组大鼠只开颅，不制备脑 损伤模型；TBI 组大鼠采用颅脑液压损伤装置，制备创伤性脑损伤模型。 2. SD 大鼠 TBI 后连续 7 d 腹腔注射 BrdU 以标记新生的神经细胞。 3. TBI 后 1、3、7、14、28 d 应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质 nestin+/sox-2+ 神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs）、GFAP+/sox-2+ 放射状胶质样细胞、 DCX+/BrdU+神经元前体细胞、MAP-2+/BrdU+新生神经元、NeuN+/BrdU+新生成熟神 经元、GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞、CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞的发生情况。 4. TBI 后 1、3、7、14、28 d 应用 TUNEL/BrdU 双标记技术检测大鼠损伤区皮质 新生细胞的凋亡情况。 5. TBI 后 1、3、7、14、28 d 应用 ELISA 法检测大鼠损伤区皮质基质细胞衍生 因子-1（stromal cell derived factor-1, SDF-1）的表达水平。 6. TBI 后 1、3、7、14、28 d 应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测大鼠脑脊液中谷氨酸含量。 Ⅱ、体外实验 1. 分离培养大鼠 TBI 后损伤区皮质内源性 NSCs（neural stem cells, NSCs）并进 行鉴定，BrdU/Nestin 免疫荧光检测其胚源性及增殖能力，MAP-2、GFAP、CNP 免疫 荧光检测其多向分化潜能。 I 2. 传至第二代的 NSCs 行谷氨酸受体 NMDA 主要功能亚基 NR1 免疫荧光标记， 流式细胞分析 NR1 阳性细胞百分比。 3. 传至第二代的 NSCs 分空白对照组（Control）、谷氨酸组（Glu）、Glu+MK-801 （0 h）组、Glu+MK-801（24 h）组 4 组分化培养：Control 组用 DMEM/F12 无血清 培养基培养；Glu 组在 DMEM/F12 无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养； Glu+MK-801(0h)组在 DMEM/F12 无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养同时加入 NMDA 受体拮抗剂 MK-801（10μM）；Glu+MK-801（24h）组在 DMEM/F12 无血清 培养基中加入谷氨酸（5μM）培养 24 h 后加 MK-801（10μM）继续培养；培养 1、3、 7、14d 后行 DCX、MAP-2 免疫荧光检测 NSCs 向神经元分化情况，TUNEL 法检测 细胞凋亡情况。 4. Control 组、Glu+MK-801（24 h）组培养 1、3、7、14d 后，应用实时 PCR 检 测 NR1 的 mRNA 表达情况，Western blot 检测 NR1 的蛋白表达情况。 5. 传至第二代的 NSCs 接种于 Transwell 培养体系的上室，分为空白对照（Control） 组、TBI 脑组织提取液（Extract）组、SDF-1 组 3 组培养：Control 组下室加入 DMEM/F12 无血清培养基；Extract 组下室加入含有 20 μl/ml TBI 脑损伤组织提取液的 DMEM/F12 无血清培养基；SDF-1 组下室加入含有 200 ng/ml SDF-1 的 DMEM/F12 无血清培养基。 培养 3 d 后行 Hoechst33342 染色检测细胞迁移情况，免疫荧光技术检测迁移细胞的趋 化因子受体 4（chemokine receptor 4, CXCR4）表达情况。 结果： Ⅰ、体内实验 1.免疫荧光技术检测损伤区皮质神经发生结果：TBI 后 1、3、7、14 d 损伤区周 围皮质出现 nestin+/sox-2+NPCs 以及 GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞，并在 3 d 时达 到高峰而后下降，在相应时间点 GFAP+/sox-2+ 放射状胶质样细胞数量少于 nestin+/sox-2+NPCs。伤后 1、3、7 d 观察到 nestin+/sox-2+NPCs 从室周带后区（posterior periventricular area, PPv）沿胼胝体向损伤区迁移；伤后 3、7、14 d 损伤区皮质观察