单分子DNA芯片制作的初步研究-园艺学专业论文.docx

万方数据 万方数据 单分子 DNA 芯片制作的初步研究 摘 要 传统的单分子 DNA 芯片制作技术主要依靠稀溶液铺设，有很大的随 机性，即有许多 DNA 分子相互重叠或间距太进，超过了光学系统的分辨 极限而无法观察，还有一部分基片上没有样品，难以使有限面积的信息 量最大化。为了克服分子堆叠，我们发展了一种新的方法，即纳米珠作 为单分子 DNA 的连接载体，利用其空间位阻作用将 DNA 分子沉降到经 过表面化学处理的基片表面。首先，3’-生物素化单链 DNA（ssDNA） 与 5’-突出的发卡 DNA（发卡处碱基用氨基修饰）杂交，然后将此带生 物素的 DNA 与抗链霉生物素包被的纳米珠以预设的“纳米珠-DNA 比” 进行杂交，获得单个纳米珠表面只连接极少量的 DNA 的复合物。由于 DNA 链本身很短且纳米珠有空间位阻，我们的方法能够保证 DNA-纳米珠复 合物很好地沉降到琥珀酰亚胺修饰的基片上。经过碱洗，发卡 DNA 将留 在基片上。Confocal 检测结果显示，使用纳米珠直径为 940 nm，DNA 链 长 15 nm，纳米珠：DNA 比例为 1：6 的复合物反复沉降 10 次制作的单 分子 DNA 芯片能够达到 700 nm 的点间距，且样点密度达到了理论最大样 点密度的 4%。这一新的 DNA 芯片制作技术将为今后单分子水平的研究开 辟新的道路。 在另一种单分子 DNA 分子的操作方法中，抗链霉生物素可以取代纳 V 米珠。不同于纳米珠有多个位点可以和 DNA 结合，抗链霉生物素只有四 个亚基可分别结合 0，1，2，3 或 4 条带生物素修饰的 DNA，这种混合 物的成分主要由抗链霉生物素和生物素修饰的 DNA 的摩尔比和反应动 力学决定，通过凝胶电泳有可能从混合物中分离出一个四聚体的抗链霉 生物素只结合一条 DNA 分子的单分子复合物。实验中通过调节带生物素 的 DNA 的长度和凝胶的浓度，找到了可以分离单分子复合物的实验条 件。这种利用抗链霉生物素分离单分子复合物的方法为单分子（包括 DNA、RNA 和蛋白质等）操作技术提供了一条新的途径。 关键词：单分子，DNA 芯片，纳米珠，空间位阻，抗链霉生物素，生物 素 VI PRELIMINARY STUDIES ON FABRICATION OF SINGLE-MOLECULE DNA CHIP ABSTRACT Conventional single-molecule DNA micro-/nano-arrays for optical detection systems are mainly fabricated through random deposition of DNA molecules on a surface. Uneven distribution of individual molecules on certain areas of the surface through these methods can lead to either overlapping or too-far-away spacing between DNA molecules. The former issue will exceed the resolution limit of a microscope, and the latter insufficient loading of DNA molecules. Both of the cases will prohibit maximization of signal collection in a limited area of the surface. To circumvent one of the problems mentioned above, overlapping between DNA molecules, we have developed a new method in which nanobeads are used as single DNA carrier and spacer for DNA delivery onto a chemically-modified surface. First, 3’-biotinylated single-standed DNA (ssDNA) is hybridized with the complementary 5’ overhang of a hairpin DNA with an amine group in its loop, followed by the biotinylated