单基因遗传病新致病基因的鉴定及其致病机制探索-遗传学专业论文.docx

上海交通大学医学院博士学位论文 上海交通大学医学院博士学位论文 - PAGE - 万方数据 单基因遗传病新致病基因的鉴定及其致病机制探索 摘要 目的：单基因遗传病又称为孟德尔遗传病，目前已报道的单基因遗传病（表型） 约有 6000 多种，已明确致病基因的约有 4000 多种，但还有 2000 多种疾病的致 病基因未知。全外显子组测序（Whole exome sequencing，WES）是指利用序列 捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉后进行高通量测序的基因组分析方 法，是目前鉴定单基因遗传病致病基因最重要的研究方法。本研究旨在基于 WES 技术发掘和鉴定新致病基因，并进行相关的致病机制研究。 方法：1. 建立包括外显子文库建立、上机测序、数据分析和变异解释验证在内 的完整 WES 方法，即利用 Agilent SureSelect 方法外显子捕获，Illumina 测序平 台进行高通量测序，测序数据经 NextGENe?软件匹配分析后，用 Ingenuity 在线 软件系统进行变异筛选确认及解释。2. 收集 16 个不同表型特征的单基因遗传病 家系为研究对象，选择家系成员（共计 24 例患者）的 DNA 样本做 WES 检测。 评估测序数据的覆盖度、深度和均一性等，生物信息学分析方法分析鉴定候选 致病基因，用 Sanger 测序法在家系成员中验证并鉴定新致病基因。3. 构建候选 基因的野生型和突变型表达质粒，比较在 HEK293T 细胞中 GDF6 蛋白的表达。 结果：1. 使用 Agilent Sureselect V4 试剂盒制备 WES 文库，99%以上的目标区 域可以被成功捕获，70%以上的 Reads 位于靶序列以内。当平均测序深度达到 100X 时，20X 以上覆盖区域92%，且均一性较为一致。采用 Illumina Hiseq2000 和 Miseq 测序平台，Reads 与人类基因组参考序列匹配度99%。每个样本约有 18,000 多个 SNVs 位于编码区，其中约 60%的变异为同义变异，40%为错义变异， 约有 60~80 个变异为无义突变、200 个为 Indels。2. 测序数据通过 Ingenuity Variant Analysis 软件分析、Sanger 测序验证后，16 个单基因遗传病家系中的 8 个家系 鉴定到了致病基因，包括 GDF6、GLI3、EXT2、GORAB、COL4A5、IDS、COMP 和 PTHLH 基因。3. 在多发性骨性连接综合征（mμltiple synostoses syndrome, SYNS）家系中鉴定到 GDF6 基因杂合错义突变 p.Y444N，该突变与家系成员骨 融合表征完全共分离，确认 GDF6 基因为 SYNS 新致病基因。4. 在转染的 293T 细胞培养液上清中，GDF6 成熟蛋白（mature-GDF6）的含量，突变型（p.Y444N） 与野生型相比明显降低。 结论：1. 本研究建立了 WES 整个实验室流程，包括文库捕获、文库质量鉴定、 上机测序、数据分析、变异解释和结果验证等。该方法捕获效率优良、测序质 量可靠、生物信息学软件全面，能够有效检测、鉴定单基因遗传病致病基因。 2. 利用 WES 技术在 SYNS 家系中鉴定到新的致病基因 GDF6 基因，错义突变 p.Y444N 可以影响 GDF6 成熟蛋白的分泌表达，可能是引起 SYNS 的致病机制 之一。 关键词： 单基因遗传病, 新致病基因，全外显子组测序，致病机制，GDF6 基因 Identification of Novel Pathogenic Genes and Study of Their Mechanisms in Monogenic Disorders Abstract Objective: Over 6000 Monogenic disorders, also known as Mendelian diseases, have been reported, about 4000 disease-causing genes have been identified. However, the pathogenic genes of over 2000 diseases remain unknown. Whole Exome Sequencing (WES) can be used to perform next-generation sequencing of exon-enriched samples and identify protein-coding mutations. It is an important tool for Mendeli