单环刺螠硫化物应激数字基因表达谱分析及硫双加氧酶功能研究-细胞生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 （必威体育官网网址的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 单环刺螠硫化物应激数字基因表达谱分析及 硫双加氧酶功能研究 摘 要 硫化物（H2S, HS-和 S2-的总称）是环境中常见的有毒物质，可对生物体产生 多种损伤甚至导致死亡。然而，人们发现一些海洋无脊椎动物具有耐受、代谢甚 至利用硫化物的能力。为了探知生物在这一过程中的分子机制，本实验选用我国 黄渤海沿岸底质中生活的一种耐硫生物单环刺螠 Urechis unicinctus 为研究对象， 采用数字基因表达谱技术分析了硫化物应激下其在转录组水平的表达特征；进一 步采用多种分子生物学技术，对单环刺螠线粒体硫化物氧化关键酶——硫双加氧 酶的表达特征和功能进行了分析。主要结果如下： 本文采用 Nla III 和 Mme I 双酶切的方法，构建了单环刺螠 50 μM 硫化物应 激下 4 个时间点（0 h、6 h、24 h 和 48 h）的 21 bp 标签测序文库；利用 Solex/Illumina 测序平台总共获得超过 1600 万个标签；去除杂质数据后获得高质量标签的数量 分别是 3,909,160（0 h）、3,613,737（6 h）、4,057,279（24 h）和 4,027,932（48 h）； 其中高质量标签能够比对上参考的单环刺螠转录组（NCBI 注册号：SRA122323） 中的基因数目分别为 21,121（0 h）、20,526（6 h）、20,129（24 h）和 20,111（48 h）。与 0 h 的表达谱相比，单环刺螠暴露在 50 μM 硫化物中的差异表达基因个数 分别是 1705（6 h）、1181（24 h）和 1494（48 h）。GO 分析发现，这些差异表达 基因大部分属于分子功能类别中的结合和催化活动亚功能组分、生物过程类别中 的细胞过程和代谢过程亚功能组分以及细胞组成类别中的细胞组成和胞内组分 亚功能组分。差异表达的基因在硫化物处理 6 h、24 h 和 48 h 的单环刺螠中分别 影响了 176、166 和 176 个信号通路；在 pathway 富集分析中发现氧化磷酸化、 核糖体、蛋白酶体、补体系统和代谢通路在 3 个硫化物应激数字基因表达谱（硫 化物处理 6 h、24 h 和 48 h）中均为差异表达基因显著富集的信号通路，其中核 糖体、补体系统和蛋白酶体等信号通路为本实验首次发现与硫化物应激相关。进 一步对能量代谢、DNA 损伤应答和炎症反应所涉差异基因的表达进行了分析， 发现在硫化物应激条件下，单环刺螠的糖酵解通路和氧化磷酸化被硫化物抑制， I 结合大部分线粒体硫化物氧化相关基因的上调表达，提出线粒体硫化物氧化既能 进行硫化物氧化解毒又是单环刺螠硫化物环境下提供能量的主要通路；在硫化物 应激条件下单环刺螠通过上调 PIDD 基因的表达，并与 NF-κB 通路和细胞凋亡 通路协作降低硫化物对其 DNA 的损伤；此外单环刺螠在硫化物刺激下还能通过 激活通路 Toll-like 受体 4 通路和 ERK 通路同时抑制补体系统，促进炎症反应和 维持自身内环境的平衡，进而使其在硫化物环境中正常生存。本实验首次在多细 胞生物中利用数字基因表达谱技术在转录组水平下揭示了硫化物应激相关基因 的表达模式。 本实验对单环刺螠硫双加氧酶的序列特征研究结果显示：其 cDNA 长度为 1976 bp，编码 293 个氨基酸，推测的氨基酸序列中含有金属 β 内酰胺酶超家族 的保守序列。利用原核表达系统获得单环刺螠硫双加氧酶野生型重组蛋白，复性 后测其比酶活为 0.80 U mg protein-1。体外原核表达了 4 个硫双加氧酶删除型重 组蛋白；通过酶活测定