单纯疱疹病毒1型ICP0真核载体的构建及其对巨噬细胞分泌活性的影响-病原生物学专业论文.docx

PAGE PAGE 10 RPMI-1640 roswell park memorial institute 1640 medium  RPMI-1640 培养基 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 SDSSDS- polyacrylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 TBS tris-buffered saline Tris 缓冲盐溶液 TEMED N,N,N,N -tetramethylethylenediamine N,N,N′,N′-四甲基乙胺 Tris Tris-(hydroxymethyl) aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 TE Tris/EDTA buffer Tris/EDTA 缓冲液 TNF-α tumor necrosis facter 肿瘤坏死因子 α 单纯疱疹病毒 1 型 ICP0 蛋白真核表达载体 的构建及其对巨噬细胞分泌活性的影响 研究生：黄靓 导师：谭立志 教授 中 文 摘 要 目的：构建ICP0真核表达载体pEGFP/ICP0，转染巨噬细胞，检测ICP0在巨噬细 胞中的表达与定位。研究GFP-ICP0融合蛋白瞬时高表达对激活巨噬细胞分泌IL - 1β、TNF-α以及NO的影响，为进一步探讨ICP0的致病性提供一定的实验依据。 方法：限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110，将目的基因连接至真核表达载体 pEGFP－C1，构建 ICP0 真核表达载体 pEGFP/ICP0。转染至巨噬细胞后，荧光 显微镜观察 ICP0 在巨噬细胞中的定位，western blotting 检测 ICP0 蛋白的表达。 用 TNF-α和 IL-1β定量试剂盒检测 LPS 激活的巨噬细胞分泌 TNF-α 和 IL-1β 的 水平，用 Griess 试剂测定经刺激后的小鼠巨噬细胞产生的 NO 水平。 结果：限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110，将该目的片断亚克隆至真核载体 pEGFP-C1 上，所构建的真核表达载体 pEGFP/ICP0 转染巨噬细胞，荧光显微镜 观察 GFP-ICP0 融合蛋白定位于细胞核，western blotting 结果表明 pEGFP/ICP0 可以在真核细胞中表达大小约为 107KD 的 GFP-ICP0 融合蛋白。转染 24h 后的 细胞加入终浓度为 100ng/mL 的 LPS 诱导，分别收集诱导后 12h、24h、48h 细胞 培养上清，ELISA 法检测上清中细胞因子 TNF-α、IL-1β 含量的变化，Griess 试 剂测定上清液中的 NO 水平。结果表明，GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达可上调 LPS 诱导的巨噬细胞细胞因子 TNF-α、IL-1β 以及 NO 的分泌，与各对照组比较，结 果有显著性差异（采用方差分析， P0.05）。 结论： 1.成功构建了 pEGFP/ICP0 真核表达载体，GFP-ICP0 融合蛋白成功表达 并定位于细胞核； GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达上调 LPS 诱导巨噬细胞分泌细胞因子 TNF-α、IL-1β； GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达上调 LPS 诱导巨噬细胞分泌 NO。 关键词：单纯疱疹病毒 1 型；GFP-ICP0；巨噬细胞；细胞因子；NO 基金项目：湖南省教育厅资助项目（NO.02c391） Construction of the herpes simplex virus 1 ICP0 eukaryotic expression vector and its effects of macrophage secrete activity ABSTRACT Objectives: To construct the eukaryotic expression vector of herpes simplex virus 1 ICP0(HS