抗原和抗体地制备.ppt

免疫学技术有在食品安全 检测中的应用 抗原的准备 抗体的制备 常用的免疫学检测技术 第一节抗原的准备 天然抗原的制备 人工抗原的制备 合成抗原 天然抗原的制备 颗粒抗原的制备 可溶性抗原 蛋白抗原 多糖抗原 颗粒抗原的制备 1、血红细胞抗原的制备： 动物的新鲜血液+抗凝剂 离心去上清 NS悬浮 离心洗涤三次（2000转/分） 颗粒抗原的制备 2、细菌抗原的制备 细菌培养（37 ℃ ，24小时） 杀菌（100 ℃ ，2小时） NS稀释 菌体抗原 胞内抗原的提取、分离和纯化 细胞的破碎 分离纯化 1、酶处理法 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点： ①适用于多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。 2、冻融法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。 特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。 3、超声破碎法 原理： ①利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 ② 超声波使用的频率从1kHz～20kHz， ③间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。 特点： ①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。 4、表面活性剂处理法 原理： 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。 常用的有： 十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。 应用： 破碎细菌，且作用比较温和。 抗原的纯化 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法 1、超速离心法 原理: 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。 应用： 用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。 2、选择性沉淀法 原理： 根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。 常用方法： 盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同），常用33～50％饱和度的硫酸胺。 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。 3、凝胶层析法 原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行分离。 常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex 柱） 4、离子交换层析法 原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。 5、亲和层析法 原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。 抗原的鉴定 1.含量鉴定：凯氏定氮法 2.理化性质鉴定 ①凝胶层析技术测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验 半抗原免疫原的制备 1.半抗原： 低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。 2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物 3.半抗原-载体