抗体库技术培训.ppt

5.4.2 应用抗体库技术改良抗体性能 5.4.2.1 改善ScFv接头的性能 5.4.2.2 提高抗体的表达量 5.4.2.3 改善抗体的特异性 5.4.2.4 提高抗体亲和力 突变策略 高亲和力克隆的选择 HOME WORK 名词解释 抗体库技术： phage antibody library phage display technology 选择型感染（selectively infective phage,SIP） 回答问题 1. 较细胞融合杂交瘤技术,抗体库技术有何优越性？ 2. 选择一种方法，从抗体库中筛选出你想要的抗体 * * Propagation 增殖 优越性： 简便易行 筛选能力强 可直接得到特异克隆编码DNA 5.2.2 噬菌体抗体库 将多样性可变基因组装到表达载体内，表达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合，即噬菌体抗体库（phage antibody library） 通过吸附-洗脱-扩增的富集过程，可有效地从噬菌体抗体库中筛选到特异性抗体的可变区基因 5.2.2.1 噬菌体抗体 1. 噬菌体抗体表达的分子片段 表达 Fab时，将轻链基因和Fd基因组合在同一个表达载体内，或不同载体导入同一个大肠杆菌细胞内，一个基因与外壳蛋白形成的融合蛋白链固定在细胞内膜上，另一链分泌到质周腔，二者可形成有活性的抗体 表达ScFv时，通过重叠延伸拼接法（replicing overlap extension, ROE）用PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在一起；构建ScFv时用可变区3’端做引物，不受重链同种型的限制，有更好的多样性。 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来. 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理 表达dsFV： 将可变区与基因Ⅲ融合，可在噬菌体表面表达出dsFv 表达 Diabody:与基因Ⅲ融合，可在噬菌体表面表达出双链抗体 2. 噬菌体抗体的表达载体 ?丝状噬菌体载体 将抗体基因克隆在基因Ⅲ5’端前导序列的下游，融合蛋白可表达 ?噬粒为基础载体 质粒含有丝状噬菌体基因间隔区 在丝状噬菌体蛋白存在时，介导噬菌体DNA的复制、包装和释放，产生子代噬菌体颗粒。 噬粒 (phagemid或phasmid) 是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的 它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点 在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA 当宿主细胞受到辅助噬菌体感染后，噬粒载体便按单链噬菌体的方式进行复制，然后由辅助噬菌体提供的外壳蛋白包装成噬菌体颗粒 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助噬菌体）子代噬菌体。 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或基因Ⅷ 融合蛋白将嵌在细菌内膜 辅助病毒感染细菌后 融合蛋白与野生型的蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ共同组装到生成的噬菌体表面 3．噬菌体抗体的价 在筛选低亲和力噬菌体抗体时可选用多价的噬菌体抗体 筛选高亲和力噬菌体抗体时应选用单价的噬菌体抗体 蛋白Ⅷ，2 700个亚基，多于10肽会影响蛋白Ⅷ功能，不能用噬菌体载体表达蛋白Ⅷ-抗体融合分子 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两者的相对数量 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体分子 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )： 用噬菌体载体产生多价抗体分子 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中10%表达有抗体分子片段，单价 4 膜型和可溶性抗体分子的表达 膜型表达 可溶性抗体分子的产生： ①在表达载体中基因Ⅲ或Ⅷ的两端设计两个适当的限制性内切酶位点，以除去外壳蛋白的基因 ②在抗体基因和外壳蛋白基因之间设计一个琥珀密码子（TAG）： a 在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，可翻译为酪氨酸、色氨酸等，表达为抗体-外壳蛋白融合分子 b 在无抑制基因的宿主菌中则UAG为终止密码子，抗体分子表达为可溶性蛋白 5.2.2.2 抗体库筛选技术 1. 用于筛选的抗原 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开的方法均可用于筛选 a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱层析 C