第三节 重组子的筛选和鉴定 - 西安电子科技大学个人主页系统.ppt

四、免疫化学检测法 　(二)免疫沉淀检测法 　　　检测分泌型产物。 　　1. 原理：抗原——抗体凝集反应。 　　2. 方法 　把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　　　Enzyme-linked immunosorbant assay 　1. 原理： 　　一抗（primary antibody）: 与目标分子特异结合。 　　二抗（secondary antibody）： 与一抗特异性结合。 　　酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 四、免疫化学检测法 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（1）固定样品 　　　将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（3）二抗结合 　　　加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（4）显色反应 　　　加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 四、免疫化学检测法 四、免疫化学检测法 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（5）比色 　　在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　3. ELISA的局限性 　　　有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody） 四、免疫化学检测法 临床检验常用的单抗 五、核酸序列分析及其他方法 　(一)PCR扩增检测法 　　1. 原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 　　2. 过程 　　（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 　　（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 　　（3）电泳PCR产物。 　　（4）检查是否有PCR产物。 　　（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。 五、核酸序列分析及其他方法 (二)DNA序列测定法 五、核酸序列分析及其他方法 (二)DNA序列测定法 五、核酸序列分析及其他方法 (二) DNA序列测定法 小　结 一般克隆与筛选策略 本章重点掌握内容 掌握转化、转导、转染的概念与区别 掌握外源基因与载体的连接方式 了解基因转移的方法与区别 掌握转化子、重组子、选择和筛选的含义 ?-半乳糖苷酶显色反应选择法的原理 核酸杂交法的原理与方法 * * 第三节 重组子的筛选与鉴定 　　　　 一、 遗传学检测法 　　　　　二、 物理检测法 三、 核酸分子杂交检测法 　　　　　四、免疫化学检测法 　　　　　五、 核酸序列分析及其他方法 第三节 重组子的筛选与鉴定 　相关概念 　转化子 　　　导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞； 　重组子 　　　含有重组DNA分子的转化子； 　筛选和选择 　　　经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 　筛选 　　　通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程； 　选择 　　　通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆的方法 一、遗传学检测法 　　　该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 　　　优点：简便、快速，结果较可靠。 　　　缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 　（一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 　　 1. 抗药性标记插入失活选择