HPLC流动相的缓冲液的配制.docVIP

HPLC流动相的缓冲液的配制 HPLC流动相的缓冲液 缓冲液流动相可以根据下面的操作步骤配制： 将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液A）。 用pH计确定或调节溶液A的pH。 将一定体积（如200ml）的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最终流动相（此处的有机相为20%）。 检查最终流动相的pH（此处为选项）。 由于测定含有有机调节剂的流动相pH计发生漂移，使其测定pH不很可靠，所以上面的步骤4 一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。 步骤1一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A1和A2）分别按计算量先溶解在水中制成水溶 液，然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期pH的溶液A。若在此步骤2中调节pH，则可以采用溶剂A滴定溶剂B，也可反过来滴定，并通过pH计测量得到所需pH的最终缓冲溶液。在大多数实验室中，pH的测量精度通常不会达到±0.05—0.1个pH单位，这会显著影响一些样品的分离。当HPLC方法对pH非常敏感时，步骤2只能大致确定pH值。 将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合，使其成为均一的溶液（不进一步调整pH），如此配得得缓冲溶液得pH可以控制在非常窄得范围内（±0.02单位），已知准确pH值得缓冲液浓溶液已有市售。 为了改善峰形或塔板数，有时在流动相中加入酸或碱（如三乙胺、乙酸等），如果这些添加剂并非为配制缓冲溶液时所采用得试剂，那么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱，使流动相达到所需的pH值。 常用缓冲液的配制 当缓冲液被稀释或浓缩时，pH也应不变。其pH值应近似恒定不变，或当其中的离解的阳离子（K+、Na+）或阴离子（Cl-、Br-）被其它种类的离子替换时，表1—4中给出了响应的配制方法，平衡阳离子为Na+，缓冲液的最终浓度为0.1mol/l，对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K+）更好，表中的数据也可供参考。较稀的或较浓的缓冲溶液，及包含有不同阳离子的溶液，其pH值会与表中的数据稍有出入。在方法建立过程中，精确的流动相pH值往往并不重要，重要的是每次新配制的流动相的pH值与第一次基本相同（最好控制在±0.02范围内）。注意，只有当缓冲溶液的pH在缓冲试剂解离常数pKIa±1范围内时，缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pKa=4.6，其适宜的pH范围为3.6—5.6）。 表1 低pH值（25℃）磷酸盐缓冲溶液的配制方法 溶液A1：0.1M磷酸。配制精确pH值缓冲液时，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。 溶液A2：0.1M磷酸二氢钠溶液，称量13.8g NaH2PO4·H2O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。 pH? ? ? ? A1体积（ml）? ? ? ? A2体积（ml）? ? ? ? ? ? ? ? pH? ? ? ? A1体积（ml）? ? ? ? A2体积（ml） 2.0? ? ? ? 565? ? ? ? 435? ? ? ? ? ? ? ? 2.8? ? ? ? 175? ? ? ? 825 2.2? ? ? ? 455? ? ? ? 545? ? ? ? ? ? ? ? 3.0? ? ? ? 110? ? ? ? 890 2.4? ? ? ? 345? ? ? ? 655? ? ? ? ? ? ? ? 3.2? ? ? ? 55? ? ? ? 945 2.6? ? ? ? 250? ? ? ? 750 表2 不同pH值（25℃）醋酸缓冲溶液的配制方法 溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。 溶液A2：0.1M醋酸钠溶液。8.2g C2H3O2Na（或13.6g C2H3O2Na·3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。 pH? ? ? ? A1体积（ml）? ? ? ? A2体积（ml）? ? ? ? pH? ? ? ? A1体积（ml）? ? ? ? A2体积（ml） 3.6? ? ? ? 926? ? ? ? 74? ? ? ? 4.8? ? ? ? 400? ? ? ? 600 3.8? ? ? ? 880? ? ? ? 120? ? ? ? 5.0? ? ? ? 296? ? ? ? 704 4.0? ? ? ? 820? ? ? ? 180? ? ? ? 5.2? ? ? ? 210? ? ? ? 790 4.2? ? ? ? 736? ? ? ? 264? ? ? ? 5.4? ? ? ? 176? ? ? ? 824 4.4? ? ? ? 610? ? ? ? 390? ? ? ? 5.6? ? ? ? 96? ? ? ? 904 4.6? ? ? ? 510? ? ? ? 490 表3 不同pH值（25℃）柠檬酸缓冲溶液的配制方法 溶液A1：0.1