土壤中分解尿素的细菌的分离与计数资料讲解.ppt

实验操作 （5）细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 结果分析与评价 1、培养物中是否有杂菌污染 对照的培养皿中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。反之，则被杂菌污染。 结果分析与评价 2、选择培养基是否筛选出菌落 牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 结果分析与评价 3、样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 结果分析与评价 4、重复组的结果是否一致 如果不同同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。 二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 [三]样品的稀释 ㈣.取样涂布 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 ㈣.取样涂布 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 稀释倍数 目的 细菌 104、105、106 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 放线菌 103、104、105 真菌 102、103、104 原因：不同微生物在土壤中含量不同 ㈤.微生物的培养与观察 思考：要将哪些培养皿进行培养？ ㈤.微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一.研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 1、实例： DNA多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 提出的问题 —如何寻找耐高温的酶？ 解决问题的思路—寻找耐高温环境； 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原理—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 什么是选择性培养基？ 筛选的方法 利用选择培养基进行分离 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 请设计：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 问：培养基选择分解尿素的微生物的原理是什么？ 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 问 怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为 唯一氮源 的培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 ?是 分离 尿素 细菌 作对照 判断实验组培养基 有无选择性 实验组 对照组 培养基类型 是否 接种 ?目的 ?结果 只生长分解尿素的细菌 生长多种微生物 是 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡.统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点 2.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行