伏马毒素分离纯化及毒性试验研究-食品科学与工程专业论文.docx

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩日期 年 月 日 伏马毒素分离纯化及毒性试验研究 摘 要 为了研究伏马毒素毒性作用，本试验研究了串珠镰刀菌在不同培养基上产毒 量随时间的变化及伏马毒素的纯度，优化得到大米培养基为最适产毒培养基。在 大米培养基上接种串珠镰刀菌得到大量产毒培养基，通过 MAX 固相萃取小柱对提 取液净化，然后经过制备液相色谱分两步制备得到 FB1、FB2、FB3。给 BALB/c 小鼠注射制备得到的 FB1，观察小鼠体重、采食量、脏器系数、血常规以及血清生 化指标。旨在填补我国 FB1 毒理学基础研究的空白，为 FB1 的分离纯化和毒性作 用机制的深入研究和畜禽生产中真菌毒素污染防控提供数据参考和理论依据。 本试验主要研究内容和结论如下： （1）伏马毒素主要是由自然界的串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生的， 本试验在 4 种不同培养基上接种串珠镰刀菌，PDA、PDB 培养基 26 ℃黑暗条件 下培养 15 d，每 3 d 采样一次；大米和玉米培养基培养 5 周，每周采样一次。通过 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测四种培养基中 FB1、FB2 的含量，结果表 明：PDA 与 PDB 培养基中 FB1、FB2 在第 9 d 达到最大含量，但含量较低；玉米 和大米培养基中 FB1、FB2 在第 28 d 达到最大，含量较高，大米培养基中 FB1、FB2 含量分别为 817.08 mg/kg、329.01 mg/kg，玉米培养基中 FB1、FB2 含量分别为 1143.40 mg/kg、460.88 mg/kg。紫外全扫描法对四种培养基提取液进行全扫描，结果表明： PDA、PDB 中杂质峰明显少于大米、玉米，而大米中杂质峰又明显少于玉米。综 上，在不影响制备效率的前提下，选择含色素等杂质较少的大米作为培养基，不 仅有利于伏马毒素的分离纯化，还能延长色谱柱的寿命。 （2）以大米作为培养基，接种串珠镰刀菌得到大量产毒基质，以 MAX 固相 净化小柱作为产毒基质提取液的前处理净化柱，通过 Unitary C18 分析色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）借助 LC-MS/MS 对流动相、梯度进行优化，使 FB1、FB2、 FB3 与杂质峰之间达到满意的分离度，然后等比例放大到制备色谱柱上，利用制备 液相色谱分两步分离纯化得到大量 FB1、FB2、FB3。所得伏马毒素经 LC-MS/MS 法定性鉴别，结果表明：在正负离子模式下（ESI-和 ESI+）进行全扫描，均得到单 一、高峰度的色谱峰。对特征峰在正离子模式下进行母离子扫描，FB1、FB2、FB3 化合物的主要分子离子峰为 722.30 [M+H]+、706.30 [M+H]+、706.30 [M+H]+；在 ESI+模式下分子离子峰 722.30 的主要二级碎片为 352.30 [M+H-2TCA-H2O]+、334.30 I [M+H-2TCA-2H2O]+和 704.35 [M+H-H2O]+；分子离子峰 706.30 的主要二级碎片为 354.30 [M+H-2TCA]+和 336.30 [M+H-2TCA-H2O]+、318.30 [M+H-2TCA-2H2O]+。 通过 UPLC-PDA 全扫描和 NMR 对 FB1、FB2、FB3 制备品进一步定性分析，结果 均表明：制备得到 FB1、FB2、FB3 的是高纯度伏马毒素。最后经过 LC-MS/MS 外 标法对所得伏马毒素的纯度进行测定，证明其纯度分别为 98.760±0.12%、99.009 ±0.08%、98.838±0.65%。24H 能制备得到 FB1、FB2、FB3 的量分别为 80mg、16mg、 16mg，回收率约为 60%。本方法操作简单，成本低，制备效率高，制备得到的 FB1、 FB2、FB3 能够作为高纯度的伏马毒素供分析研究使用，为伏马毒素的深入研究和 应用提供基础。 （3）将 80 只 BALB/c 小鼠随机分成 4 组，每组 20 只，分别为对照组（灌胃 灭菌生理盐水）、低剂量组（0.5 mg/kg.bw）、中剂量组（1.5 mg/kg.bw）和高剂量 组（4.5 mg/kg.bw ），喂饲实验室分离纯化的 FB1，观察不同剂量的 FB1 对 BALB/c 小鼠体重、采食量、脏器系数、血常规以及血清生化指标，结果表明：随着 FB1 添加剂量的增加，小鼠采食量呈逐渐降低趋势，小鼠体增重也呈降低趋势，Sa/So 的比值逐渐增大，但未见统计学差异；不同剂量 FB1 处理，小鼠心脏和肝脏指数 未呈现变化，但 FB1 灌胃剂量超过 1.5 mg/k