低氧预处理增强骨髓间充质干细胞对心肌细胞凋亡的保护作用-内科学(心血管病)专业论文.docx

PAGE PAGE 1 英文缩略词表 英文缩写 英文全名 中文名称 MSCs Mesenchymical stem cells 间充质干细胞 SD Sprague-Dawley 史－道二氏大鼠 IHD Ischmic heart disease 缺血性心脏病 DMEM Dulbecco modified Eagle medium Dulbecco 改进的 Ea 养基 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 VEGF Vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子 IL-6 Interleukin-6 白介素-6 bFGF Basic fibroblast growth factor 成纤维细胞生长因 HGF Hepatocyte growth factor 肝细胞生长因子 MTT 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 噻唑蓝 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 PBS Phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲 PI Propidium Iodide 碘化丙啶 SDF-1 Stromal cell-derived factor 1 基质细胞衍生因子 1 ER Endoplasmic rdticulum 内质网 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 低氧预处理增强骨髓间充质干细胞对心肌细胞 凋亡的保护作用 中文摘要 目的：体外模拟心肌细胞缺血微环境，探索经过低氧预处理的骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）对持续缺氧诱导的心肌细胞凋亡的 影响及可能的机制。 方法: ① 实验动物及细胞：健康 SPF 级，雄性 Sprague-Dawley 大鼠若干只，实验 过程中对动物的处置符合动物伦理学标准；大鼠心肌细胞株：H9c2(2-1),购自博士 德公司，货号：CX0125。② MSCs 分离、培养及鉴定：采用贴壁法结合消化控制 法体外培养骨髓 MSCs，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。③ MSCs 条件培养 液的制备：取第四代 MSCs 细胞，接种贴壁后，加上不含血清的低糖 Dulbecco’s modified Engle’s medium(DMEM)培养液，分别于 37℃、体积分数为 5%的 CO2 培 养箱和厌氧培养箱中继续培养 48h 后，收集培养液离心后取上清，分别为 MSCs 条件培养液和 MSCs 低氧条件培养液，-20℃保存。④实验方案：心肌细胞分为 4 组：心肌细胞置于 37℃、5%的 CO2 培养箱中培养 72 小时(正常组)，心肌细胞置于 厌氧培养箱中培养 72 小时（单纯缺氧组），心肌细胞加上 MSCs 条件培养液后于 厌氧培养箱中培养 72 小时（MSCs 组），心肌细胞加上 MSCs 低氧条件培养液后于 厌氧培养箱中培养 72 小时（MSCs 低氧组）。⑤指标检测：MTT 检测各组细胞活 力变化，Annexin V-FITC 双染标记心肌细胞凋亡，免疫组化检测各组 Bax 和 Bcl-2 蛋白的表达。 结果：① 原代细胞接种 24h 后可见少量贴壁细胞，首次换夜后可见散的贴壁细胞， 呈短梭形、椭圆形、三角形等形态；换夜传代后，细胞形态趋于一致，呈长梭形， 细胞呈集落式生长，集落外观呈“漩涡”状。② 流式细胞仪检测第 4 代 MSCs 表面 标记, CD31，CD45 表达阴性, CD44，CD54 表达阳性，符合骨髓间充质干细胞的 特点。③细胞活力的检测结果显示：与正常组相比,其他三组的细胞活力均降低（P ＜0.05）， 而与单纯缺氧组和 MSCs 组相比，MSCs 低氧组的细胞活力较高（P＜ 0.05）。④与正常组相比，单纯缺氧组心肌细胞凋亡率显著增大（P＜0.05）；与单 纯缺氧组相比，MSCs 组和 MSCs 低氧组凋亡率均降低（P＜0.05）；而与 MSCs 组相比，MSCs 低氧组凋亡率较低（P＜0.05）。⑤免疫组化光密度结果显示：与单 纯缺氧组和 MSCs 组相比，MSCs 低氧组 Bcl-2 表达上调，Bax 表达显著下调， Bcl-2／Bax 比值增大（P＜0.05）。 结论：MSCs 对缺氧诱导的心肌细胞凋亡产生的保护作用与旁分泌机制有关，且是 通过调节 Bcl-2／Bax 比值来实现的，而低氧能增强这种保护效应， 【关键词】 间充质干细胞；缺氧； 心肌细胞； 凋亡 The antiapoptotic effect of Bone marrow mesenchymal ste