精子畸形试验新.doc

PAGE PAGE 130 十三、精子畸形试验 Sperm Malformation Test 1 范围 本规范规定了动物精子畸形试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。 2 引用标准 GB 14924 试验动物与饲料标准 GB 15193·94 食品安全性毒理学评价程序 3 定义 精子畸形 （sperm malformation） 指精子形态的异常改变。 4 原理 已知精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。常染色体和Y-性连锁基因突变及某些染色体重排，如性-常染色体易位，也可使精子发生畸形。 小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成、发育的影响，可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用。 5 试验的基本原则 通过适当的途径使动物接触受试物，经过一定时间后处死动物，取其附睾，制备涂片，经固定、染色，在显微镜下计数畸形精子。 6 仪器和器械 生物显微镜、解剖剪、镊子、表面皿、离心管、小漏斗、吸管、滴管、载玻片、擦镜纸等。 试剂 7.1 1%伊红染色液 称取伊红1g溶于100mL蒸馏水中。 7.2 生理盐水、甲醇（A.R） 8 实验动物和饲养环境 常规使用动物是雄性小鼠。6周~8周龄，体重为30g ~35g。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 9 剂量分组 受试物至少设三个剂量组。分别取1/2、1/5、1/10或1/20LD50剂量。当受试物的LD50大于5g/kg体重时，可取5g/kg体重为最高剂量。另外设阴性（溶剂）对照组和阳性物对照组。常用溶剂为水、生理盐水、植物油（玉米油、花生油）等。阳性物对照组可采用环磷酰胺40mg/kg/日。每组至少有5只存活动物。 10 染毒途径和方式 染毒途径视实验目的而定。常用途径为经口灌胃方式。受试物各剂量组、阴性对照组和阳性物对照组的动物，均连续染毒5d，每日一次。一般于首次染毒后的第35d处死动物。 11 试验方法 11.1 制片 用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀，涂片。 11.2 固定 待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。 11.3 染色 将涂片于1%伊红染液中染色1h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。 11.4 观察与计数 首先，在低倍镜下选择背景清晰、精子分布均匀、重叠较少的区域，然后，在高倍镜下观察结构完整的1000个精子，计数其中畸形的精子。精子畸形主要表现在头部。按Wyrobeks的分类标准，主要类型有：无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头及双尾。无尾精子、头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计数。判断双头、双尾精子时，要注意与两条精子的部分重叠相区别。 12 数据处理和结果判断 每只动物应按精子畸形类型分别记录，以便计算各实验组的精子畸形发生率和精子畸形类型的构成比。 利用Wilcoxon秩和检验法和其他适当的统计学方法。将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行比较。 精子畸形试验阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组的倍量或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应关系者。 一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%~3.4%，但每个实验室应有自己稳定的精子自发畸形率。 13 试验报告 试验报告应包括以下内容： （1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂； （2）动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号和动物级别）； （3）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号； （4）剂量分组，染毒途径和方式； （5）试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法； （6）结果：以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率和精子畸形类型分析的结果 （表1和表2）； （7）结论。 表1 ×××精子畸形发生率 组 别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 受检精子总数 (个) 畸变精子数(个) 畸变率 （%） P值 受 试 物 溶剂对照 阳性物对照(mg/kg) 注：畸变率以均数?标准差表示。 表2 ×××精子畸形类型分析 组 别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 受检精子总数(个) 精子畸形分类及比例（%） 无钩 香蕉形 胖头 无定型 其他 总计 受 试 物 溶剂对照 阳性物对照(mg/kg)