第二十章常用分子生物学技术原理与其应用.pptVIP

PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5 端之间的DNA片段。 基因芯片的原理：双色荧光探针杂交 将两个不同来源样品的mRNA逆转录合成cDNA时用不同的荧光分子（正常用红色，肿瘤用绿色）进行标记，标记的cDNA 等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的激发光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。绿色荧光-该基因只在肿瘤组织表达；红色荧光-正常组织表达；黄色-两种组织均表达。 双色荧光标记探针基因芯片工作流程示意图 二、蛋白质芯片 蛋白质分子间的亲和反应：抗原-抗体或受体-配体 最常用的探针蛋白是抗体。 蛋白质芯片(protein chip) 蛋白质芯片作用原理 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 样品标记法蛋白质芯片工作流程示意图 第五节 生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 目 录 PCR技术原理示意图 模板DNA PCR技术对模板质和量的要求并不十分严格。 一般来说宜用ng量的克隆DNA，μg水平的染色体DNA作起始材料。 特异性引物 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 耐热DNA聚合酶（耐热Taq DNA聚合酶 ） dNTPs Mg2+ 缓冲液 水 PCR反应体系的基本组成成分 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因的体外突变 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基