甜瓜SKIP同源基因的克隆及表达特性分析.doc

甜瓜同源基因的克隆及表达特性分析 干旱、寒冷、盐碱等非生物逆境是制约着植物生长的主要因素，在目前生态 环境日益恶化的状况下，提高植物的抗逆性有关研究无疑具有重大意义Uj。运用 基因工程手段来提高植物的抗逆性则比传统育种方式更有优势［2］。目前研究表 明，SKIP基因作为一种植物抗旱相关转录因子，在逆境胁迫中呈现表达量的明 显增加。本实验应用RT-PCR技术克隆得到甜瓜S/C/P同源基因。利用Real-time PCR技术检测基因对甜瓜根、茎、叶不同组织屮的表达情况进行初步鉴定。 关键词：甜瓜SKIP同源基因克隆Real-Time PCR 1绪论 SKIP基因及其蛋白功能 SKIP蛋白的结构特点 几乎在所有的真核生物基因组中都存在编码SA7P(Ski-interacting protein)的 基因，从低等真核生物到高等的动、植物中都有拷贝。SKIP蛋白大小约60-80KDa, 一般情况下定位于细胞核中从氨基酸序列的一级结构比较可以发现，SKIP 蛋白的基本结构中含有多个其它蛋白所不具有的高度保守的结构。并且这些保守 的区域几乎都是SKIP所特有的，即在其它的蛋白质屮没有发现它们的同源序列, 其中SNWKN是最典型的高度保守的基序。某些物种的SKIP蛋白还奋一些显著 的磷酸化位点。预测的二级结构显示，在第299位氨基酸到第360位氨基酸之间 存在一个a螺旋，其等电点很高，是很多互作蛋白结合的部位［41。而且它的其他 部分也可以和不同蛋白质相结合，因此SKIP能够与多种类型的蛋白质发生互作 ［3］。此外，SKIP蛋白的有些部分还存在一种部分折叠的状态，以便于它在和不 同蛋白互作后发生可以完成再次折叠W，这样的结构特点使它具有超强的与蛋白 发生互作的能力(Alonso et al.,2002)oSKIP家族进化树比较中，除酵母中的PRp45 外大多数蛋白都具有相同的序列特征。这个蛋白不仅缺失N端部分，余下的区 域特征与其它蛋白的相似性也较低。 1.1.2 SKIP的功能及研究现状 SKIP蛋白的功能可以概括为两大类，一个是作为RNA剪切复合体的组成部分 参与前体mRNA的剪切、转录延伸及成熟mRNA的运输［3］;另一个则是根据其 结合的蛋白的不同，在与其它转录因子结合形成转录调控复合体的表达屮，进行 共调节与共抑制的转换角色W。 自20世纪80年代，SKIP同源蛋白在果蝇中被首次鉴定并命名为Bx42以来, 在其他物种中的研宄随即展开1998年，人类的SKIP被证明参与了剪接复合 体，随后酿酒酵母的PRP45也被认为是完成mRNA的剪接过程中不可或缺的辅 助因子［8］。并且，酿酒酵母PRP45蛋白也被报道含有SNW/SKIP结构域，并在 保持细胞活性中发挥重要功能。虽然SKIP蛋白家族成员本身具奋极苏保守的结 构和序列，但不同种类生物中的SKIP蛋白具有其完全不同的结合蛋白，这也表 明该蛋白在基本功能上进化和衍生出来的新功能在不同物种中都各不相同f91。根 据对水稻、拟南芥等模式植物的研允过程显示，植物除了通过表达特定基因提高 植物耐受性以外，RNA剪接的调控也是一种植物抵抗外界非生物逆境胁迫的方 式L1Qj。对拟南芥SKIP同源基因AtSKIP基因研究表明，SKIP是mRNA剪接的转 录因子，在前体mRNA剪接作用中通过直接与前体mRNA结合发挥左右，而且 AtSKIP蛋白既是一个积极的调节因子也是潸在的转录因子，在非生物逆境胁迫 的信号转导通路中也起到一定的作用。在对于水稻抗逆基因OsSKIPa研宂中发 现，OsSKIPa能够调整细胞活力及抗逆性。转基因水稻屮OsSKIPa的表达极人 地提高了植株在逆境中的生长阶段的抗旱能力，增加清除活性氧的能力和提高干 旱胁迫下于逆境相关基因的转录水平［3］。2012年张彦威从大豆中克隆得到一个编 码SKIP的基因，命名为GmGBPl，在PEG6000干旱胁迫处理大豆叶片中发现， 叶片中GmGBP/基因呈正调控应答，且在4h时达到高峰［11］。王小敏等人通过对 玉米SKIP同源基因克隆得到ZmSKIP基因，并对玉米屮ZmSKIP氨基酸序列进 行分析发现，ZmSKIP也具奋一个特定核定位信号肽，这与已报道的SKIP蛋白 都是核定位蛋白相一致［12］。 转录因子蛋白主要通过与目的基因启动子中特定元件的结合来调控下游基 因的表达，发挥其生物功能，而SKIP是真核生物中的转录共激活子，在转录和 剪接屮发挥保守的共激活的作用。并且SKIP通过与不同蛋白互作，更突显其在 mRNA生成的不同阶段的多个环节中的功能。冋吋，S/C/P还作为重要的转录因 子调节植物抵抗逆境胁迫的能力。 1.2研究的意义及技术路线 1.2.1研究的意义 盐碱、寒冷和干旱等逆境环境对植物生长发育的影响具有重耍影响，并且间 接关系到