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分子标记及其在植物遗传育种中的应用 形态标记 遗传学上稳定、可见的外部特征 ---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。 细胞学标记 染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。 生化标记——贮藏蛋白和同工酶 贮藏蛋白 同工酶 特点：经济、方便、成本较低 结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。 分子标记 本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。 分子标记的分类（Staub等1996） 植物遗传研究中常用的分子标记 RFLP — Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD—Random Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR) SSR —Simple Sequence Repeat AFLP —Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP 原理： DNA 限制性内切酶酶切 电泳 转移到硝酸纤维素滤膜 同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交 胶片放射自显影，显示酶切片段大小 酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：EtBr染色20分钟 变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印迹 冲洗：以2×SSC 冼胶，风干 —杂交—洗脱 预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5× HSB、DenhardtⅢ）中， 封好后置65℃温箱中振荡5－6小时。 杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱中振荡过夜。 洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃ 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。 —放射自显影 将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70℃超低温冰箱中曝光10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。 RFLP探针 来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针 cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。 gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。 玉米RFLP探针：/probes. Html 探针标记—随机引物法 25 ng变性DNA 5ul 寡聚核苷酸 2ul BSA 3ul [α-32P]dCTP 2ul Klenow酶 加水至50ul，37℃温箱中标记2小时 RFLP标记特点 RAPD 原理： 用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。 Polymerase Chain Reaction-PCR RAPD的操作 PCR反应： DNA（20ng/μl） 1μl Primer 15ng 10×Buffer 2.0μl Mg2+（25mM） 1.2μl Taq酶（5U/μl） 0.15μl dNTP（25mM） 0.2μl 加水至20μl，再加入石腊油，进行PCR扩增 Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 15秒 Step3 36℃ 30秒 Step4 72℃ 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72℃ 5分钟 ? 主要特点 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； DNA需要量少，引物便宜，成本较低； 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。 不同物种间引物通用； 缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。 DAF(DNA amplification fingerprinting)： 与RA