课件：手足口病标本采集及检测技术方案.ppt

2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （2）实验设计 （3）RT-PCR扩增反应和条件 （1）引物序列合成 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （1）引物序列合成 国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列： PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3` PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3` 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 2）EV71核酸检测引物序列： EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3` EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3` 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 3）CVA16核酸检测引物序列： CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3` CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3` 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （2）实验设计 1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。 2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。 A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。 C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。 三、实验室检测操作流程 * （三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （3）RT-PCR扩增反应和条件 1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上； 2）配下列试剂主溶液： 10×PCR Buffer·····························································5.0μl dNTPs（2.5mM each）···················································2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）····················································1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）····················································1.0μl RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）···············································0.5μl AMV逆转录酶（10U/μl）················································1.0μl 模板RNA·······································································3.0μl RNase Free dH2O··························································36.0μl