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实验七 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 3.了解测定血清谷丙转氨酶活性的临床意义 1.掌握金氏法测定血清谷丙转氨酶活性的原理 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定具体操作方法 将α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α-酮基上，生成相应的酮酸与氨基酸的反应。催化这一反应的酶称为转氨酶。 转氨作用： 也称氨基转移酶，是一组催化氨基在?-氨基酸与?-酮酸之间转移的酶。是一种细胞内酶，当细胞膜通透性增加或细胞死亡时释放到血液中。 转氨酶 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性均较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内两种酶维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。 转氨作用的机制： 体内主要两种转氨酶？ 谷丙转氨酶（GPT）又称丙氨酸转氨酶（ALT） 谷草转氨酶（GOT）又称天冬氨酸转氨酶（AST） 肝脏 心脏 谷丙转氨酶：催化谷氨酸和丙氨酸之间的转化的转氨酶，其结构式反应如下： 血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义 谷丙转氨酶广泛存在于机体各组织中。正常人血清中此酶浓度活性很低，肝细胞中该酶浓度活性极高，当肝细胞受损时此酶从细胞中释放血。因此测定血清ALT活性对于某些疾病的诊断和预后判断具有重要的参考价值。 （1）血清ALT活性增高：肝胆疾病、药物和毒物 （2）ALT活性降低：磷酸吡哆醛缺乏症。 ALT在临床上主要用于肝脏疾病的诊断 酶活性：是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量。即酶反应速度。 酶活性的影响因素 样品处理 测定条件 溶血 抗凝剂 存放时间 温度 pH 时间 底物浓度 酶浓度 常用的谷丙转氨酶酶活性测定方法有： 1 金氏法（King法） 2 赖氏法（Mohun 法） 3 改良穆氏法（Reitman-Frankel法） 共同点：原理、试剂、操作步骤和作用时间相似。 不同点：在于单位定义和标准曲线绘制方法不同，因此测定结果的单位数值不同。 在37℃,1ml血清与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸为1个活性单位 第一步反应： 第二步反应： 520nm CH3 α-丙酮酸 2 标准曲线的制备 1 测定酶活性 试剂 试管编号 测定管 对照管 丙氨酸氨基转移酶底物液（ml） 0.5 0.5 置于37℃ 水浴中预温5min 血清（ml） 0.1 置于37℃水浴60min —— 2,4一二硝基苯肼溶液（ml） 0.5 0.5 血清（ml） —— 0.1 各管混匀后，置于37℃ 水浴中保温20min 0.4 mol/L NaOH溶液（ml） 5.0 5.0 混匀，10min后，30min内在520nm处比色，以对照管调零，读取测定管吸光度值。 1 测定酶活性 取试管2支，按下表3-13操作 表3-13 试剂 试管编号 1 2 3 4 5 6 2 μmol /L丙酮酸标准液（ml） —— 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶底物液（ml） 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/L磷酸缓冲液(ml) 相当于丙酮酸实际量 （μmol） 0.10 0 0.10 0.10 0.10 0.20 0.10 0.30 0.10 0.40 0.10 0.50 各管混匀后 2,4一二硝基苯肼溶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 各管混匀后，置于37℃ 水浴中保温20min。 0.4 mol/L NaOH溶液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，10min后，30min内在520nm处比色。以第1管调零，读取各管吸光度值。 2 标准曲线的制备 取6支试管，编号，按下表3-12步骤操作： 表3-12 试管编号 1 2 3 4 5 6 吸光度（A） 丙酮酸含量 （ μmol ） 试管编号 对照管 测定管 吸光度（A） 表2 丙酮酸标准曲线的绘制 表1 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性 原始数据记录 1 标准曲线图绘制 1）用坐标纸绘制标准曲线 2）标明操作人、时间、仪器型号和图表名称 1.标准曲线图绘制 1.标准曲线要过原点 2.注明标准曲线名称