课件：2005级开题报告-邓岩ppt.ppt

第二部分 实验目的 22 实验目的 1. RASSF1A 基因的高甲基化和RASSF1A 基因的表达在鼻咽癌转移方面有无统计学意义 23 实验目的 2.通过5’-氮杂脱氧胞苷联合放疗对RASSF1A 基因的表达的影响，研究该药物、放疗各自的疗效和联合疗效 24 第三部分 技术路线 25 鼻咽癌细胞系接种裸鼠 RASSF1A基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系表达 5’-氮杂脱氧胞苷处理 检测RASSF1A基因甲基化水平 分析比较其差异性 RASSF1A基因及蛋白表达 放疗 空白对照 5’氮杂脱氧胞苷联合放疗 鼻咽癌组织 正常组织 免疫组织化学 检测RASSF1A蛋白 26 主要实验方法 （一）甲基化特异性PCR（MSP） MSP法原理:单链DNA的胞嘧啶(C)可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶(U),而5 甲基胞嘧啶(5 mC)则不能被修饰,仍保持为5 甲基胞嘧啶(5 mC),根据5 甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同,发生甲基化与未发生甲基化DNA的上游引物之间的差别为胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T),下游引物的差别为鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)。据此设计甲基化(p16m)等位基因特异引物和非甲基化(p16u)引物,用这两对引物对同一模板进行扩增来检测待扩增片段的甲基化状况。能用p16m引物扩增的,说明了该扩增片段已发生了甲基化,能用p16u引物扩增的,说明了该扩增片段没发生甲基化,如用两对引物都能扩出,则说明了该扩增片段存在部分程度的甲基化。本研究所扩增的片段位于启动子和第一外显子,其引物序列见表 - 27 硕士研究生开题报告 （一）甲基化特异性PCR（MSP） 引物引物序列 bp p16m(上游)5′ TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 3′150 p16m(下游)5′ GACCCCGAACCGCGACCGTAA 3′ 150 p16u(上游)5′ TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 3′ 151 p16u(下游)5′ CAACCCCAAACCACAACCATAA 3′ 151 PCR:反应总体积50μl,包括经亚硫酸钠修饰后的模板DNA约50ng,引物各300dNTP1.25mmol/L,1.25UDNA聚合酶,1* PCR缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol/L Tris HClpH8.8、10mmol/L2-巯基乙醇67mmol/LMgCl2)反应条件为95℃热启动15m,然后于95℃30s、60℃30s、72℃30s各循环35次,最后于72℃延伸10min,同时以正常人外周血淋巴细胞(PBI)DNA作为阴性对照[3],以水作为空白对照。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统观察,拍照。 28 主要实验方法 （一）逆转录PCR 1、 抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总RNA，42oC完成 2、引物Oligo（dT）15：正义引物5’-TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3’;反义产物5’-GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3’ 3、? 内对照：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） 4、? 扩增产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶（小心，强烈致瘤剂）染色 5、??测定RASSF1A和GAPDH基因产物条带吸光度的相对比值。该比值表示RASSF1A基因的相对表达强度。 - 29 主要实验方法 5’氮杂脱氧胞苷 5 aza CdR1.0μmol/L（可以采用的浓度分别为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0μmol/L） 免疫组织化学技术 放疗 DT36Gy/18次 － 30 第四部分 预期结果 31 1. 未用5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度高，能与转移能力正相关 32 2. 未用5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗前测RASSF1A表达正常组织高，鼻咽癌组织低，表达能力与转移能力负相关 33 3.用5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗后 34 ? 5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗组 5’ 氮杂脱氧胞苷组 放疗组 空白对照组 RASSF1A 较高 较高 较高 低 甲基化 较低 较低 较低 高 35 第五部分 经费预算 36 编号 项目 经费(元) 1 RT-PCR 与MSP 12000 元 2 免疫组织化学 3000 元 3 细胞培养基本材料及裸鼠