环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺构建新型非病毒转基因载体及其应用-肿瘤学专业论文.docxVIP

浙江大擘博士论文 浙江大擘博士论文 黄宏靓 氨基酸的简写 A Ala(灿anine) 丙氨酸 C Cys(CysteLne} 半胱氨酸 D Asp(Aspamc acid) 天冬氨酸 E Glu(GlutaInic acid) 谷氨酸 F Phe(Phenylalanine) 苯丙氨酸 G Gly(Glycine) 甘氨酸 H His(I-Iistidine) 组氨酸 I lie(Isoleucine) 异亮氨酸 K Lys(Lysine) 赖氨酸 L Leu(Leucine) 亮氨酸 M Met(Methionine) 甲硫氨酸(蛋氨酸) N Ash(Asparagine) 天冬酰胺 P Pro(Proline) 脯氨酸 Q Gln(Glutamine) 谷氨酰胺 R Arg(Arginine) 精氨酸 S Ser (Serine) 丝氨酸 T Thr (Threonine) 苏氨酸 V Val(Valine) 缬氨酸 Y Tyr(Tyrosine) 酪氨酸 W Trp(Tryptophan) 色氨酸 浙江大学博士论文 浙江大学博士论文 黄宏靓 环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺构建新型非病毒转基因 载体及其应用 专业 肿瘤学 博士生 黄宏靓 导师 余海教授 中文摘要 基因治疗是将人正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞 来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上 的缺陷或错误，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达 到治疗的目的。现在基因治疗已经进行了较多的研究，并且有一些研究已经 进入临床试验阶段。现在全世界范围内已经批准的基因治疗临床试验方案超 过了1200项，其中近70％是针对恶性肿瘤的治疗。 在基因治疗的实施中，有四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二 是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的有效安全的转基因载体体系，三 是选择合适有效的转基因途径，四是如何使治疗基因在靶细胞中特异性表 达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因载体体系是制约基因治 疗实施的一个主要瓶颈。目前基因治疗使用最多的转基因载体是腺病毒和逆 转录病毒载体，约占治疗使用载体总数的50％。病毒载体具有很高的转基因 效率，但使用病毒载体有许多缺点，主要包括病毒载体有较强的免疫原性， 大量使用会产生较强的免疫反应，出现的首例基因治疗导致死亡的病例是在 使用重组腺病毒载体治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶部分缺陷症的病人，由于大 剂量注射重组病毒激发了机体严重的免疫反应，多器官衰竭导致死亡。此外 病毒载体的应用还有出现插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化， 而且病毒载体有限的携带DNA能力，不利于大规模的生产也是限制其应用 的主要缺点。 非病毒载体与病毒载体相比，其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原 性，不具备插入突变的能力，易于大规模生产和生产成本较低。但非病毒载 4 浙江大学博士论文 浙江大学博士论文 黄宏靓 体的最大缺点是其转基因效率较低。理想的非病毒转基因载体应该是可以降 解的，毒性很低的，有较高转基因效率，并且具备靶向到目标细胞或是组织 的能力，使治疗基因在靶细胞或组织中发挥作用。 为了寻找理想的非病毒转基因载体，目前以阳离子多聚物作为转基因载 体的研究较多。其中一种阳离子多聚物多聚乙烯亚胺(PEI，polyethylenimine) 研究是最多的。PEI是经过酸催化氮丙啶单体聚合，可以形成线型或分枝状 的聚合物结构，有较高的阳性电荷，与带有阴性电荷的DNA或RNA结合能 力较强，可以与DNA或RNA形成复合物粘附到细胞表面被细胞内吞。PEI 有很多质子化的多级氨的氮原子，当溶酶体内的pH下降时，PEI能够大量 捕获质子，并引起CI内流，导致溶酶体渗透性肿胀，最后溶酶体破裂从而 将内吞的DNA释放到细胞质(即质子海绵效应)，DNA释放后进入细胞核中 并表达。PEI的分子量的范围变化很大，一般应用于转基因载体的PEI的分 子量在5000．25000 Da。高分子量的PEI转基因效率很高，如分枝状25000 Da PEI(PEI 25 kDa)，但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低，但一般而言其 转基因效率很低，并且PEI作为转基因载体直接体内应用会导致红细胞的聚 集，可以与血液中的白蛋白等非特异性结合，导致聚合体的形成，体内应用 转基因效率低，一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。 修饰PEI的目的主要是降低PEI的毒性，提高PEI和DNA复合物的稳定性， 提高靶向性，减少与白蛋白的非特异性结合，延长体内的时间等等。考虑到 高分子量的PEI毒性很大，本研究选择低毒的低分子量PEI进行修饰，通过 与羟丙基环糊精偶联形成新的共聚物，再经过系列试验筛选得到高转基因效 率的新型转基因载