课件：Western blotting蛋白免疫印迹实验.pptx

蛋白免疫印迹 （Western Blot）; WB的基础;目 录;1.1 蛋白免疫印迹的概念;1.2 蛋白免疫印迹的应用;1.2 蛋白免疫印迹的应用;1.3 WB的原理;1.4 WB的特点;目 录;2.1 试剂;丙烯酰胺 ;RIPA裂解液;2.1 试剂配置;2.1 试剂配置;2.1 试剂配置;2.2 耗材;2.3 设备;2.3 设备;2.3 设备;目 录;3.1 实验步骤;3.1.1 蛋白样品制备;a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。 b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混匀。 ;3.1.2 蛋白含量测定;3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳;3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳;清洗玻璃板;清洗玻璃板;清洗玻璃板;3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳;3.1.4 转膜;3.1.5 封闭;3.1.6 一抗杂交;3.1.7 二抗杂交;WB显色的分类;放射自显影;底物化学发光ECL;底物荧光ECF;底物DAB呈色;3.1.8 显影检测;3.2 结果分析;3.3 注意事项; WB的基础;常见问题解答;常见问题解答;两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?;为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？;Western-blot?制胶时好多泡泡怎么办？;问答时间;WB标准实验-试剂耗材与设备;WB标准实验-试剂配置;SDS蛋白上样缓冲液: pH6.8的0.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，一般为 20-25μL，总蛋白量100μg。 Tris缓冲盐溶液(TBS): 20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。 10xTris-甘氨酸电泳缓冲液: 30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL。 临用前稀释 10 倍。 ;WB标准实验流程;WB标准实验流程;清洗玻璃板;Component;剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。;;谢谢聆听！