课件：乙肝病毒核酸检测实验操作流程.ppt

乙肝病毒核酸检测实验操作流程 广西临床检验中心 唐 娟 主要内容 HBV-DNA的检测原理 HBV-DNA操作流程 HBV-DNA检测结果分析 临床意义 DNA 提取 PCR 扩增 标本采集 检测原理 HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA 原理图 每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 操作流程 一、标本采集 一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管 室温（22～25oC）放置30～60 分钟血标本使用水平离心机，4000转/分离心5分钟 吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管 血 清 的 采 集 血 浆 的 采 集 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管 立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀 5～10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管 注意事项 尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min） 血清 血清 不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取过程中完全去除 血浆 二.HBV-DNA的提取 打开HBV-DNA试剂盒 ↓↓ 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） ↓↓ 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 ↓↓ 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） ↓↓ 12000rpm，离心10min ↓↓ 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀） （阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul） ↓↓ 100℃恒温干浴10min ↓↓ 12000rpm离心5min 注意事项 1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不能用移液器混匀 2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至190ul一次性吸取。 注意事项 3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。 4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。 5.裂解温度要确保有100℃±1，裂解时间10min±1 三.PCR 扩增步骤 取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中 ↓↓ 编辑软件，设置循环条件 ↓↓ 保存文件，运行 注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。 循环条件 循环次数、温度 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环 结果分析 1. 2.结果读取 3.结果报告 结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告多少；也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可，不能报告“0”或阴性 临床意义 1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指 标，为临床提供准确的实验依据。 3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。 4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。 5、研究HBV分子流行病学。 * * * * * * * * * * 高等教育 * * * * * * * * * *