环巴胺阻断Hedgehog通路对食管癌细胞的影响及分子机制研究消化内科学专业论文.docxVIP

I I PAGE PAGE VI 中文摘要 汕头大学医学院硕士学位论文 目的： 通过 Hedgehog（Hh）信号途径的特异性抑制剂环巴胺（cyclopamine）在体外干预食 管癌细胞，观察环巴胺在体外对食管癌细胞生长的影响，并探讨其可能的分子机制，以期 为环巴胺应用于食管癌的治疗提供实验室数据。 方法： 体外培养人食管癌EC9706细胞株，用不同浓度环巴胺处理，通过MTT检测细胞凋亡率， 了解环巴胺在体外对食管癌细胞的促凋亡作用；通过AO/EB双荧光染色在细胞形态学方面 观察环巴胺对食管癌细胞的影响；通过流式细胞术检测环巴胺对食管癌细胞凋亡的影响； 通过Western blot检测环巴胺对食管癌细胞中Gli-1蛋白表达的影响。 结果： 1） MTT法实验结果 检测不同浓度的环巴胺作用不同时间对EC9706细胞生长的影响， 结果显示DMSO组对EC9706细胞无明显增殖抑制作用，与空白对照组相比差异无统计学意义 (p0.05)。环巴胺组（浓度分别为2.5、5、10、20μmol/L）对EC9706细胞生长均有显著 抑制作用，抑制作用随浓度增大而增大，与对照组相比差异有统计学意义。 2） AO/EB双荧光染色结果 荧光显微镜下可见环巴胺组有特征明显的早期凋亡细胞， 并且凋亡细胞随药物浓度的增加而增多，见图1。可见细胞体积缩小，细胞变圆，边缘毛 糙，形成不规则突起，细胞核集，固缩。 3） EC9706细胞的凋亡情况 使用Annexin FITC/PI双染法后经流式细胞仪测定了不 同浓度环巴胺作用EC9706细胞24h后细胞的凋亡率分别为(7.73±1.25)％ 、(13.37± 1.42)％ 、(22.3±1.92)％、(33.57±1.75)％，DMSO组细胞的凋亡率为（2.14±0.16）%， 不加药对照组细胞的凋亡率(2.23±0.22)％，环巴胺对EC9706细胞有诱导其凋亡作用，不 同浓度环巴胺组与对照组比较差异均有统计学意义(p＜0.05)，且细胞凋亡率随环巴胺浓 度增大而增加。见图2。 4） Western blot结果 不同浓度环巴胺处理细胞24h后，随着药物浓度逐渐增加， Gli-1蛋白表达逐渐减少，而内参β-actin蛋白表达无明显变化。经图像处理系统分析， β-actin灰度值为参照，得出DMSO组和空白对照组无显著差异（p＞0.05），但环巴胺组与 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 空白对照组相比有统计学差异（p＜0.01），并且具有浓度依赖性。见图3。 结论： 1） Hedgehog 信号通路在食管癌 EC9706 细胞中是被激活的。 2） 环巴胺对人食管癌细胞株 EC9706 有生长抑制作用,随着药物度的增加其抑制作用 越明显，但是未证实存在时间依赖性。 3） 环巴胺主要通过促进细胞凋亡抑制细胞生长，其机制可能与调节 Gli-1 蛋白的表 达有关。 关键词：食管癌；Hedgehog 信号通路；环巴胺；细胞凋亡；Gli-1 蛋白 PAGE PAGE VII PAGE PAGE IV The Study of Cyclopamine Block Hedgehog Signaling Pathway to Esophageal Carcinoma Cells and The Underlying Mechanisms Postgraduate Liu Zhaohui Supervisor Guo Guanghua (Department of gastroenterology,The first affiliated hospital of Shantou university medical college) Abstract Objective: Treating esophageal cancer cells in vitro through the Hh signal pathway inhibitor cyclopamine , to observe the effect of the biological behavior of esophageal cancer cell cyclopamine in vitro, to provide laboratory data for treatment of cyclopamine in esophageal cancer. Methods: Culturing human esophageal cancer cell EC9706 in vitro, with different concentration of amine treatment lin