课件：CTC检测技术.ppt

* 免疫捕获法——磁珠分选 原理： 将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成“靶细胞—抗原抗体—磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞. 分选策略 阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。 负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化 阳性富集 CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）/MACS?Cell Separation 磁性细胞分选系统 原理： 采用抗EpCAM（CD326）结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCs 特点： 捕获的CTCs纯度较高 能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCs 无法捕获到间质型CTCs（EpCAM阴性） magnet Anti-EpCAM Coated ferrofluids 7.5ml Anti-CK (epithelial cells) Anti-CD45 (WBCs) DAPI (viable cells ) Automated fluorescence detection system magnet 使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒，使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。 阳性富集-CellsearchTM CTC WBC CellsearchTM CTCs鉴定 CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性 Cellsearch在各癌种中的检出率 芯片的表层排布了78 000个包被抗 EpCAM抗体的微位点 血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上 阳性富集- CTCs-Chip 原理： 联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs 联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌 通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs 特点： 较单一使用EpCAM抗体更特异 不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCs PCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性 阳性富集- Adna Test 检测系统 免疫捕获技术缺陷（一代技术） 技术应用分析 参考文献 CTCs分离 具有特定表面抗原 分离效率高，纯度高 J Transl Med. 2012, 10: 138. Clin Cancer Res. 2011, 17(2): 337-45. 间质细胞表型CTC 间质细胞表型CTC不表达上皮细胞标志物（如EpCAM） Breast Cancer Res. 2008, 10(4): R69. BMC Cancer. 2012, 12: 178. CTM CTM多为间质细胞表型 CTM体积大导致捕获效率低 操作步骤多易使CTM人为分散 Am J Pathol. 2011, 178(3): 989-96. Cancers. 2010, 2, 1236-1250. 血小板包裹CTC 抗体与抗原结合受血小板包裹阻隔 Cancer Cell. 2011, 20(5): 576-90. CTCs分型 只分离获得特定类别的CTC，因此无法分型 CTCs分析 只能分析特定类别的CTC 阴性富集 Cyttel/Cytelligen 检测系统 原理: 利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用 下去除白细胞，CTCs被富集沉淀 特点： 可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs 样本处理步骤多，CTCs易丢失 阴性筛选法--Cyttel 步骤较多，CTCs容易丢失 鉴定不稳定 判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增； 特异性不足 基于细胞大小过滤 原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC 代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET） 方法：将全血经过带小孔8μm的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞 富集得到CTCs. 特点： 细胞完整性好； 可完全分离上皮型、间质型CTCs； 可检出循环肿瘤拴子； 局限：不宜检出细胞直径小于8μm的肿瘤 如神经内分泌瘤 HepG2 cells stained with anti-KL1 滤膜法 密度梯度离心 原理： 根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCs OncoQuick分离体系 方法： 密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介 质层中，洗脱后得到CTCs. 特点：可分离CK阳性和阴性细胞 局限性： CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失； CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失； 与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关； 用血量多15-30ml 流式细胞术 原理： 根