共聚焦（无图）.ppt

潘伯群 -1- 书面实验报告： 1 如何判断共聚焦图片的荧光质量？ 2 影响共聚焦图像质量的硬件因素有哪些？ 请同学们撰写好实验报告后，下次实习前由各班班长收齐并交给中心负责教学的王老师处！ 评判荧光样品制备是否有成功，可从以下几个方面考量： 1．荧光标记反应的特异性和荧光信号定位准确性 2．保持样品的结构形态的完整性和免疫活性 3．荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 4．荧光强度 5．荧光稳定性 6．荧光信号的分布的一致性 7．两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性 8．背景噪声干扰性 影响获取图像质量主要的共聚焦参数： （1）检测针孔（Detector Pinhole ） （2）激光功率(Power) （3）声光控制器（ AOTF--Acousto Optic Tunable Filter) （4）光电倍增管增益及静噪控制（PMT Gain PMT Offset） （5）重复扫描-数字减噪（Li.A.、Aver.） （6）扫描图分辨率（Format）: 除此以外 物镜（Objective）、 扫描速度（Scan Speed） 扫描方向（Unidirectional Scan / Bidirectional Scan） (X-Direction) 数码放大（Zoom In） …………… Speed Zoom （二） 固定组织时应注意 : ①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理； ②组织块不宜过大过厚，必须小于2cmXl.5cmx0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内； ③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果； ④组织固定后应充分水洗。 （三）薄片样本（Thin Samples） 对于单层培养的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是获取高分辨率的图像，由于介质薄，因而折射系数的匹配问题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜（63XGlyc、100XOil）。 （四）厚片样本（Thick Samples） 对于厚样本（20－2mm）在使用中应注意： 盖玻片要贴紧样本，不要留有空隙，以免工作距离不够产生象差； 采用工作距离足够长的物镜（10X、20X或40X），不可以用油镜，油镜的工作距离短，会顶破盖玻片，损坏样本，甚至物镜，且成像也不清晰； 进行断层成像会有荧光损失，从而影响图像的质量，采取提高检测针孔[Pinhole≥1(AU)],增加激光穿透性； 在进行“Continuous”扫描时，找到最亮的层面进行调焦调整相应参数。 （五）玻片处理和涂胶 对易造成细胞、组织脱片的问题采取以下两措施，可防止脱片现象出现。 1．载玻片和盖玻片处理新载玻片上有油污，必须经过清洁液浸泡12～24h，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上，浸泡在95％酒精内2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短，清洁液浸泡只需2h，流水冲洗注意勿损伤玻片等。不主张用烘烤箱干燥。 2.载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂； （六）自发荧光（Autofluorescence） 首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？是否是杂质？所选择的荧光染料与之必须不同； 亮度如何？如果太亮需要避开、减弱； 是否需要它？通常情况下，有助于确定染色区的定位； 来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？ 淬灭、漂白； 苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光； 组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。 组织自发荧光淬灭剂 AutoFluo Quencher * 一.概述 二.影响共聚焦检测质量的主要设备参数 三.因样本的处理不当影响共聚焦检测质量的 因素 四.样本制作过程需要注意的问题 光电倍增管 检测针孔 光源针孔 光源 分色镜 物镜 样本 聚集平面 一.概述 二.影响共聚焦检测质量的主要设备参数 三.样本的处理及影响共聚焦检测质量的因素 四.样本制作过程需要注意的问题 Pinhole 检测针孔：默认值=1，数值1解像度较好， 数值1讯燥比较好 Pin=0.2 Pin=1 Pin=2 光电倍增管 PMT PMT gain /PMT ffset 体会值： 480 ~ 500 Gain 680 ~760 - 8 ~ - 0 Offest + 0 ~ + 2 0 255 0 255 0 255 用线平均法进行线扫描 用线平均法进行线扫描 Line Aversge的作用是使用平均法线扫描的图像，即对每条线进行重复多次的扫描，并求每个采样点的算术平均值。 体会值：常用2、4，ACCU扫描模式选4、8。 Aversge的功能