课件：乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.ppt

INNO-LiPA 法是一种反向分子杂交的方法,预先将多个特异性探针包埋在硝酸纤维素膜上,再与变性的DNA 片段反向杂交,然后显色,最后根据探针特异核苷酸确定待测DNA片段的核苷酸序列。 又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray)。 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。 当病毒载量较高（HBV DNA105copies/ml）时， 弱势株与野毒株比例相差不大时，优势株与弱势基本等效扩增，随着比例的不平衡的加剧，竞争抑制也越明显，当模板W:M=10:1时，检测结果显示W:M≌45:1，与实际情况相差较大。当病毒载量较低时（HBV DNA105copies/ml），弱势株可能被完全抑制。 随着变异毒株在总病毒量中的比例逐渐增加，ΔCti-c及ΔCtv-c值也逐渐减小，检测结果基本反应了各模板的实际比例。 脉冲激光照射到基质与样品混合物，基质吸收能量而爆炸，导致样品离子化。离子化的分子在强电场的作用下被加速，获得动能，然后沿飞行管无场区飞行。离子的质量与其飞行时间的平方成正比。故可通过测量离子在管中的飞行时间来求其分子量。 在YMDD区上游引入一酶切位点，使得PCR产物可被酶切成片段，因其分子量不同，可被MALDI-TOF MS检测到。 在拉米夫定治疗过程中， YMDD变异株一直存在。尽管出现YMDD变异意味着病毒学突破的可能性增加，但是少量YMDD变异株的存在不足以预示病毒学突破。当YMDD变异株的比例大于野毒株的5倍时，病毒学突破的风险大为增加。 Biological Sample Analyze data Scanner microarray “Hybridize” arrayer Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546. 优点 局限性 大通量 技术和设备的要求高 快速 检测成本高 灵敏度高 可平行检测 探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针 引物末端碱基定点突变扩增技术 高分辨熔解曲线法 HBV DNA105copies/ml W:M=1:1 HBV DNA105copies/ml W:M=10:1 HBV DNA105copies/ml W:M=10:1 ：W ：M 优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 费时短 影响因素多，存在一定误判 特异性探针，其Tm值不同 溶解曲线分析 酶切分子量.JPG 优点： 高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于1%的变异株。 局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。 Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-16 1Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a test’s ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na,