课件：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验.ppt

Ames试验，即污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。B.N.Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。 ?原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。即组氨酸突变菌(his-) 在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+)，可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。 ?是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。 ? Ames试验 标准试验菌株(配套菌株)：有四种 TA98、TA97 ：检测移码突变 TA100：检测碱基置换突变 TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性 ? Ames试验 ?不加S9 混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物 ?加S9 混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物 ? Ames试验 常规方法： ?斑点试验 ?平板掺入试验 斑点试验： 1、吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9混合液，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。 2、用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。 3、平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。 平板掺入试验： 1、将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml－0.4ml S9混合液，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。 2、同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个～5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。 3、同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。 鼠伤寒沙门氏菌 野生型（his＋） 鼠伤寒沙门氏菌 突变型（his－） 正向突变 回复突变 受试物 试验菌种 (his-) S9 试验菌种 (his-) S9 Ames试验原理 结果判断: ? 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物 ? 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物 ? Ames试验 应用 1．斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。 2．平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的剂量较低。点试获阳性结果的浓度用于掺入试验（每皿0.1ml），往往出现抑（杀）菌作用。 3．致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时间延长至72h。 　　 应用 4．挥发性的液体和气体试样，可用干燥器内试验法进行测试。 5．目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。但是，与今天快信息、高效率的社会要求相比，该试验程序还嫌繁琐，方法不够简便，有待于创建新的更为快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期生物测试法。