课件：乙肝病毒DNA的实验室检测.ppt

LOREM IPSUM DOLOR 1、荧光定量PCR技术 2、乙肝病毒的感染 3、HBV-DNA与临床 荧光定量PCR技术 荧光定量PCR技术 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP） 荧光定量PCR技术 PCR 反应过程 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq 酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应组分 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 延 伸 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ 重 复 退 火 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 循环2 4个拷贝 循环3 8个拷贝 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 荧光定量PCR原理 插入染料法 SYBR Green I 杂交探针法(最常用) TaqMan TaqMan探针 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应体系 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Taq l 5’ 3’ R Q Probe 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ R Q 退 火 5’ 3’ 1. 链取代 Taq 3’ Q R 5’ 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ 2. 水 解 3. 聚 合 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 4. 检测荧光 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ l 乙肝病毒的感染 乙肝病毒的感染 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 　　　　一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 　　　　提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好 乙肝病毒的感染 （二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态； 2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。 HBsAg(－)　 HBV-DNA(＋) 　　　　 　 HBeAg (－) HBV-DNA(＋) 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。 乙肝病毒的感染 5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右 HBeAg与HBV DNA有着良好的相关性 4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。 乙肝病毒的感染 HBV DNA HBV DNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准 ALT 正常 增高或者波动 正常 增高或者波动 免疫耐受期 免疫清除期 非活动或低（非）复制期 再活动期 肝组织学 无明显异常, 或轻度炎症纤维化 中度或严重炎症、纤维化快速进展 无炎症或仅有轻度炎症 中度或严重炎症、肝纤维化 临床诊断 慢性HBV携带者 HBeAg阳性慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化 非活动性HBsAg携带者 HBeAg阴性 慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化 乙肝病毒的感染 慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009 HBV DNA检测的临床意义 HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎 　PCR检测 “窗口期” 核酸检测缩短的“窗口期”的天数 HBV 56 6-15 HCV 70 41-60 HIV 22 10-15 有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断 提供直接证据缩短“窗口期”