课件：酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立.ppt

①实验前半小时从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。选取精确移液管，恒温孵育前振摇过程不可忽略。 ②操作过程应准确无误，实验中稀释液、酶标液、质控物、阴阳性对照和标本的加入量一定要准确，防止阳性对照和未知阳性标本的溅洒造成假阳性结果，以及感染操作人员。 ③孵育温度和时间是夹心抗体（或抗原）形成、竞争结合反应的必要因素，因此要严格控制。一般来说，温度提高而抗原抗体结合的时间可缩短，否则时间延长，所以在试验前要选择最佳温度与时间。 ④洗涤时间洗板时应使洗液注满反应孔，调节洗板次数，保证洗板彻底。洗涤的干净程度直接影响结果。洗板是ELISA 检测的重要环节，应严格按说明书进行，达到洗涤次数和间隔时间要求，从而保证结果的准确度。 所有检测孔均无色：原因可能为酶结合物或底物失效、底物漏加（错加） 、阳性对照漏加或错加，其中以酶结合物失效和底物错加为常见。查找原因的方法是将酶结合物与底物直接混合，观察有无显色；如显色则提示为阳性对照漏加或底物错加所致；若不显色，用新酶结合物与底物混合，观察有无显色；不显色则提示底物失效，显色提示原用酶结合物失效。 所有检测孔均显色：原因多为洗板不净（孔内残留未结合的酶结合物）或显色时间过长。 肥达氏诊断伤寒为经典血清学检验主要检测血清中抗体，从感染到血中产生抗体要有一定时间，而且操作繁琐，结果慢（过夜观察）。 伤寒杆菌抗原酶免ELISA其包被和酶标记抗体均针对伤寒杆菌的单克隆抗体直接检测血清中抗原特异性强、快速、操作简便、从加样到判读实验结果仅需45min。 两法通过χ2检验P0.05，具有显著性差异，可作为早期快速辅助诊断伤寒的血清学方法。 近年来由于: ①抗生素及皮质激素的使用有抑制抗体滴度作用。 ②有些患者感染较轻产生抗体较少。 ③患者体弱免疫反映弱缺乏丙种球蛋白不能产生抗体。 少数患者肥达氏凝集效价始终不高，且肥达氏反应阳性反应出现较晚。单凭肥达氏反映诊断伤寒有其局限性，易出现漏诊，因此早期采用单克隆抗体检测血清中抗原帮助临床及早辅助诊断伤寒。 ①在抗体的制备过程中，免疫动物的选择，设计有效的免疫程序均可影响制备的抗体质量。实验中采用伤寒沙门菌O抗原，通过耳缘静脉注射和多点背部皮内注射免疫健康家兔，制备伤寒沙门氏菌O抗体。 ②与家兔个体有关，免疫的家兔免疫功能强大，产生抗体量较多。 ③家兔是否每次均被抗原免疫到也是实验成功的关键，获得高效价抗体，也与足量的伤寒沙门氏菌菌体抗原和成功注入有关。 ④抗原直接进入血液被免疫细胞包裹而缓慢地释放，有利于持续地刺激免疫系统。但免疫时要注意抗原浓度和剂量的掌握，避免因抗原浓度太高和抗原剂量太大造成家兔死亡，而太低则不足以刺激机体产生特异的免疫应答。 ⑤所用的伤寒O抗原纯化度好。 在医学研究和临床诊断上，广泛地应用ELISA技术来检测与感染性疾病有关的病原因子及其相应的抗体、体液中的其他抗原成分、激素和药物等。 ELISA酶免疫测定商品试剂检测的项目可分为以下各类。 ①病原体及其抗体的检测。病毒感染如肝炎病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、疮疹病毒、 轮状病毒、义滋病病毒(HIV)、非典病毒(SARS)等；细菌感染如链球菌、布氏杆菌等； 寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 ②蛋白质。各种免疫球蛋白；肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶； 激素如HCG、FSH、TSH、hGH；酶如肌酸激酶-MB；其他蛋自质如铁蛋自等。 ③非肽类激素。如T1、T4、雌二醇、皮质醇等。 ④药物。治疗心肌病药物如地谷新、抗哮喘药物如茶碱、抗癫痫药物如苯巴比妥、抗生素如庆大霉素等。 ELISA除了在医学检测中的应用外，还在食品检测，水产品检测，植物病毒检测，动物检疫检测，农药残留检测，兽药残留检测，捕食作用研究等多个方面有广泛的应用价值。 李金泽，郑欣宁，杨芳芳，郑思涵 2015年11月9日 伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但在目前的传染病防治中，仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”，指许多热性疾病，在中医学属于“湿温”病范畴，与现代医学的伤寒与副伤寒，具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病，并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症，单核吞噬细胞系统的增生性反应，以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。 伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多 。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。 一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检