杂交探针.PPT

单个Taqman? microRNA定量 茎环, microRNA 特异的RT primer 定量PCR利用TaqMan水解探针 ?很少会检测到前体 ?区分一个碱基的差异 ?一个样本一次RT ?样本准备较麻烦 ?取决于DNA引物–灵敏度有限 ?Taqman探针会与RT 引物(PCR 引物重叠)-难以保证非特异性. ?不可能检测到非特异性扩增(无融解曲线) 优点： But * 通用 RT样本输入量更少 * miRCURY LNA? Universal-RT PCR system -简单和高效的样品处理和数据分析 GenEx software 1份RNA样品 1 pg per assay 20 ng per plate 35 μL血清/血浆 per plate 1 反转录 3 小时实验 无需预先扩增 * miRCURY LNA? Universal-RT PCR system– microRNA扩增的特异性和灵敏度 1pg 100ng * microRNA 靶序列中不同位置的单个碱基差异 * 即用型panel(384孔、96孔),高通量筛选 人，小鼠/大鼠，742 miRNA,2 Plates,40 ng总RNA或70 μL血清/血浆 小鼠/大鼠，372 miRNA, 1 plate: 20ng 总RNA 或35 μL 血清/血浆 Pick--Mix microRNA PCR Panel, 96 well Ready-to-Use-New!-定制专属你的panel! 单个引物，pre-designed 和validated(人，小鼠和大鼠) 1250种，人，小鼠和大鼠miRNA；对照基因 最小1pg即可检测 LNA?定制引物-在线设计 试剂-经优化的miRNA引物 cDNA 合成试剂盒 SYBR?Green 预混液 Exiqon GenEx 数据分析软件 * microRNAs的功能研究 利用miRNA inhibitors and mimics去调节miRNA的活性 寻找表型变化或是靶基因的表达变化(mRNA 或蛋白水平) 单独或利用文库knockdown 体内实验 miRNA mimics (synthetic duplexes，目前暂无此类产品) miRNA inhibitors (单链LNA, 与miRNA成熟体结合) * 近年来，研究者们对人类基因组的关注主要集中在编码蛋白质的基因和蛋白质本身。随着人类基因组计划的完成和哺乳类转录组数据的不断积累，揭示出人类和其他高级真核生物的遗传物质只有极小一部分编码蛋白质，而超过97％的转录产物是功能多样的RNA分子，即非编码RNA（non—coding RNA，ncRNA）。ncRNA是转录组的一个主要组成部分，其功能复杂多样，大大扩展了人们对基因转录调控复杂性的认识，回答了人们对基因组中非编码序列存在意义的部分困惑。这个领域的研究日益成为功能基因组研究的新焦点。 * 1993年，LEE在线虫中发现了Lin-4 * Compare two probes, one with DNA only and one with LNA only. Hybridization to two targets, one perfect and one with a mismatch. LNA much higher Tm – and a much bigger delta Tm – this is important. Increased Tm – one MM gives a high delta Tm – MM discrimination and specificity * Show melting curve of a DNA oligo duplex. Low temp, duplex formation. As T increases the oligos will melt. At 50% melting = Tm. Ar higher T there will be single stranded onligs only. DNA less difference in Tm for perfect match and single mismatch = low delta Tm LNA big difference in Tm for perfect match and single mismatch = high delta Tm If hybridization is performed at a certain Temp there will be a signal from perfect match and from mismatch. Fo