PGM测序方法-protocol.docx

314芯片测序方法 文库构建： PCR扩增基因组DNA 的目标区域 选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。对每一个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR 管内。以下表格提供了包含和未包含Ion AmpliSeq? Sample ID Panel的反应体系。对多个反应可准备配置混合溶液。 2X 引物池 (Cat. nos. 4477685, 4477686, and custom panels) 成分 不包含ID panel（ul） 包含ID panel（ul） 5X Ion AmpliSeq? HiFi Mix 4 4 2X Ion AmpliSeq? Primer Pool 10 10 可选: 20X Ion AmpliSeq? Sample ID Panel -- 1 gDNA, 10 ng Y Y Nuclease-free Water 6-Y 5-Y 总体积 20 20 5X 引物池(Cat. nos. 4471262 and 4475346) 成分 不包含ID panel（ul） 包含ID panel（ul） 5X Ion AmpliSeq? HiFi Mix 4 4 5X Ion AmpliSeq? Primer Pool 4 4 可选: 20X Ion AmpliSeq? Sample ID Panel -- 1 gDNA, 10 ng Y Y Nuclease-free Water 12-Y 11-Y 总体积 20 20 充分震荡，简单离心。 将PCR管置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上目标区域。 阶段 步骤 温度 时间 持续 酶活化 99℃ 2分钟 循环数（根据下表格设置） 变性 99℃ 15秒 退火/延伸 60℃ 4/8/16*分钟 持续 -- 10℃ 持续+ *4分钟是对≤1536对引物池；8分钟是对1537-6144对引物池；16分钟是对6145-24576对引物池。 +PCR产物可置于10℃过夜储存。 引物对数目 循环数 标准DNA 石蜡包埋DNA 12-24 21 24 25-48 20 23 49-96 19 22 97-192 18 21 193-384 17 20 385-768 16 19 769-1536 15 18 1537-3072 14 17 3073-6144 13 16 6145-12288 12 15 12289-24576 11 14 注意： Ready‐to‐use panels: 当加入Ion AmpliSeq? Sample ID panel时不需要调整循环数。Custom primer pools：如果一个custom 设计的panel中包含两个引物池，并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。 一般标准样品可以增加一个循环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个循环。 如果引物池有两管及以上，应当分别扩增（10μl体系）。扩增完后混合取20μl进行下轮实验。 暂停点 – PCR产物可以储存在10°C过夜，需要更长时间储存，可以置于–20°C. 部分消化引物序列 轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。往每个混合反应液中加入2微升 FuPa?Reagent?，总体系达到22微升。 充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀） 将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。 温度 时间 50℃ 10分钟 55℃ 10分钟 60℃ 20分钟 10℃ 持续（最长至1小时） 将接头连接至扩增产物并纯化 配置并运行连接反应 如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。 小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch溶液和接头。 成分 体积 (μL) Switch Solution 4 稀释的barcode接头混合物 2 总体积 28 在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。 4.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀） 5.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。 温度 时间 22℃ 30分钟 72℃ 10分钟 10℃ 持续（最长至1小时） 暂停点 – 产物可以置于–20°C保存。 纯化未扩增的文库 使用Agencourt? AMPure? XP试剂1.5x样本体积 重要事项! –将AMPure??XP?reagent?置于室温并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。对每个样品，混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。 将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（1.5x样本体积