七园盘电泳分离血清蛋白.PPT

生物化学实验 2006.5 目 录 实验一 糖类的定量测定 实验二 纸层析法分析氨基酸 实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 实验四 酵母RNA的提取及含量测定 实验五 凝胶层析法测定蛋白质分子量 实验六 蛋白质含量测定的二种方法 实验七 园盘电泳分离血清蛋白 实验一 糖类的定量测定 —3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 一、实验目的 1．掌握3，5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。 2．用3，5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉 中总糖。 3．熟悉分光光度计的原理及使用方法。 二、实验原理 糖类的测定方法有物理方法和化学方法两类。 由于化学方法比较准确，常常用于还原糖的测定。 是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。 3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。 该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少。 三、实验操作 （一）样品中总糖的水解及提取 准确称取山芋粉1g，放入小三角烧瓶中，加入10ml6N HCL和15ml蒸馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞试剂一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶，稀释到刻度，备用。 （二）葡萄糖标准曲线的制作，取7支大试管分别按表1-1顺序加入各种试剂。 表1-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量 将以上各管溶液混匀后，用分光光度计(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出标准曲线。一大组同学做一个标准曲线 （三）样品中含糖量的测定 取4支大试管，分别按表1—2加入各种试剂。 表1—2测定样品中含糖量时各试剂的用量 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的总糖含量，按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量。 总糖=（水解后还原mg数×样品稀释倍数×100％）/样品重量 四、实验要求 1.实验过程中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准确。 2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。 3.分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。 4.移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。 5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂瓶等，以防试剂污染仪器。 6.每组同学离开实验室时，须经实验老师检查并同意后，方可离开。 7.值日生打扫干净实验室后，方可离开。  实验二 纸层析法分析氨基酸 一、实验目的 1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。 二、实验原理 纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。 Rf值的定义： Rf =(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离） 影响Rf值的因素有： ①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。 三、实验操作 1．纸的处理 取18