hsBAFF增强胞内钙离子控B淋巴细胞ERK活性和增殖机理研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docx

摘要 摘 要 本研究运用细胞培养、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和Western bloting等 免疫学和细胞分子生物学技术，选用BAPTA／AM钙离子鳌合剂靶向耗竭胞内钙 离子活性，综合研究和观察了hsBAFF诱发B淋巴细胞胞内游离Ca2+浓度 ([cali)变化及其与B淋巴细胞ERKl／2活性和增殖的关系，探讨了hsBAFF 上调B淋巴细胞【cali水平的作用和分子机理。结果如下： l hsBAFF对体外培养的脾脏B淋巴细胞【caZ+1i的影响 研究hsBAFF对体外培养的鼠脾脏B淋巴细胞胞内游离ca¨浓度([c铲+】i) 的影响，探讨hsBAFF调控B淋巴细胞增殖的细胞学机制。分离的原代培养小鼠 脾脏B淋巴细胞，分为对照组和3个hsBAFF处理(1．0、2．5和5．0 p幽[Id)组。 分别在实验后oh、12 h、24 h，收集细胞并用单抗B220标记以显示B淋巴细胞， 再以荧光探针Fluo．3／AM负载，然后通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)或流 式细胞仪(flow cytometry，FCM)分析B淋巴细胞内Ca2+荧光强度。结果显???， hsBAFF处理组B淋巴细胞较对照组细胞形态好、活力强：tca2qi荧光强度显著 高于对照组，且Ca2+荧光强度的变化发生在hsBAFF刺激细胞增殖前。暗示： hsBAFF能够通过上调细胞[c神i水平活化B淋巴细胞。 2 hsBAFF增强[Ca2qi稳态调控B淋巴细胞增殖和反应 探讨hsBAFF增强[Ca2li稳态的作用和意义。采用抗cD．19磁珠分离纯化B 淋巴细胞。分离的B淋巴细胞接种到96孔培养板，实验分为对照组(PBS)、标 准品hBAFF(2 I-tg／rm)和5个hSBAFF(0．5，1，2，3和5}tg／m1)处理组。采用 MTT法分析hsBAFF对B淋巴细胞增殖作用。纯化的鼠脾B淋巴细胞接种到96 孔培养板，实验分为对照组、hsBAFF(2．5rtg／mD处理组、Tg(0．5 0M)处理组 和hsBAFF+Tg处理组，各处理组细胞在培养箱中培养48h(37℃，5％C02)后， 采用MTT分析细胞存活率。结果显示，hsBAFF以剂量依赖的方式刺激B淋巴 细胞增殖且明显高于对照组。2 H∥“的hsBAFF和标准品hBAFF作用B淋巴细 胞效应相近。Tg明显降低B淋巴细胞存活率，然而，hsBAFF明显削弱或缓解 Tg导致的B淋巴细胞活力降低。 暗示：hSBAFF在增强B淋巴细胞[c神i稳态 调控B淋巴细胞增殖和反应中具有重要作用。 3 hsBAFF期IIC．2qi调控B淋巴细胞ERKl／2活性机理研究 采用抗CD一19磁珠分离B淋巴细胞；选用BAPTMAM钙离子鳌合剂靶向耗 竭胞内钙离子活性，以细胞免疫化学和Western Blot技术分析hsBAFF(2．5斗g／m1) 和BAPTA／AM(20州)．单一或联合作用B淋巴细胞ERKl／2磷酸化表达。探 讨hSBAFF增强【C矿】i调控B淋巴细胞ERK活性机理。结果显示，hsBAFF引起 磷酸化ERKl／2水平从4 h开始明显上升一直持续到24 h，但当BAPTA／AM耗竭 hsBAFF增强的【caZ+】i时，在24 h内的每一个时间点ERKl／2磷酸化明显下降。 提示：hsBAFF上调[cali连接着ERKI／2信号的激活，进而促进B淋巴细胞增 殖。 关键词：hsBAFF；B淋巴细胞；钙离子；毒胡萝卜素(Tg)；ERKl／2；增殖 梁军清：hsBAFF增强胞内钙离子调控B淋巴细胞ERK活性和增殖机理研究 2 Summary— The present study systemically investigated the change of recombinant human soluble BAFF(hsBAFF)-induced intraeeUular Ca2*concentration(【C一1i)and its effect on ERKl／2 activity and proliferation in in vitro B lymphocytes by using the methods of eell culture，flow cytometry,laser scanning confocal microscope， immunocytochemistry and western bloting assay,as well as chosing BAPTA／AM，a chelator for targeting exhaustion of intracellular Ca2+activity．Futher the molecular mechanisms of hsBAFF．upre