CreloxP定位重组系统植物雄不育和杂种优势中的利用研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 堕主兰堡笙奎 堕主兰堡笙奎 里型!!竺塞堡重望至竺垄堕塑堡至蔓塑茎壁垡茎±堕型旦里窒查苎查兰竺!!兰一 摘 要 Cre—loxP是来源于噬菌体Pl的一种位点特异性重组系统。目前，它已广泛应用于 基因功能鉴定，动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在 杂种优势的利用中具有重要意义。它的应用能够简化制种程序，降低种子成本，提高 种子纯度，带来更大的经济效益。本实验麓r是以Cre．10xP系统调控细胞毒素基因barnase 荏植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达，从而达到控制植物育性的目的。 ／1．在本实验中，通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylo幻uefacien$的 b扣∞e基因，克服了其极强的致死效应，构建成功双元表达载体及基因枪转化载体， 井已获得经分子检测呈阳性的小麦植株。 2．参照Paddon CJ等的研究结果，设计了barnase的抑制因子barstar的引物序列， 通过PCR方法克隆得到了完全正确的barstar基因。含有该基因的用于小麦及烟草的 育性恢复的双元表达载体已经成功构建，并且得到了转基因阳性植株。 3．os96B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子，它在小孢子发育的四分体 时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达，它具有较为严紧的时空特异 性。以os96B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP位点特异性重组系统的适用于基 因枪法转化小麦的载体系统。目前，转基因小麦己分别得到且自交后代已经播种。另 外，以含有Cre基因的转基因小麦为母本，以含有阻断序列的小麦为父本所进行的组 合后代已种入田间，交配后代的育性情况正在进一步的观察、检测中。 4．对应于小麦的基因枪法转化载体系统，仍以os96B为启动子，构建了～组受控 于Cre／IoxP的用于控制双子叶植物育性的双元表达载体系统。目前，已获得转基因烟 草自交种子。以转阻断序列结构为母本，以转Cre基因为父本所进行的杂交组合种子 也已经获得。 5．转不育基因(096B—bamase)小麦植株生长正常，但开花后，花粉量明显减少， 自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现，转基因小麦大部分花粉表现为败育。 花粉离体萌发试验表明，转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低，几近败育。说明以 os96B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。 6．以转cre基因的烟草作为受体，以含阻断序列的质粒农杆菌进行二次转化。二次 转化株营养生长正常，但开花期花器官表现异常。具体表现为花瓣异常开裂或不开裂， 花丝变短或粘连，花药提早萎蔫或异常开裂。推测这种现象的出现与启动子的组织特 异性或bmnase的渗露表达有关。 7．二次转化株花粉染色因不同株系出现全部败育、部分不育和多数可育的情况。 花粉离体萌发实验也得到了相似的结果。这说明通过筛选，利用Cre／loxP得到完全不 育的植物株系是完全可行的。 I 王 王 勇 摘 要 2002年5月 8．获得了9个bamase的突变体，初步推测第十四位氨基酸及第八十位氨基酸与核 糖核酸酶活性有关。同时，发现bamase的第316位核苷酸序列为易突变位点，自然 发生的突变多插入一个C，从而产生终止位点的改变。这或许会为今后barnase的克隆 与利用提供一些参考。 关键词：ere-IoxP位点特异性重组系统，转基因雄性不育，核糖核酸酶基因，杂 秽优势，绒毡蜃；二硅启动子 II 苎圭兰焦笙苎 苎圭兰焦笙苎 !型生!塞堡墨望墨竺壅竺望堡至!塑塞翌垡塑主塑型里翌塞』墨苎窒坐：!!兰一 Abstract Cre／IoxP is a site．specific recombination system from phage P1．Presently,it has been extensively used in the identification ofgene function，genome modification，gene expression and gene regulation in plants，animals and microorganisms．Male sterility is an important character in the utilization ofhybrid heterosis，and an important aim ofplant breeding as well． This work Was designed tO control plant fertility by cell lethal gene Barnase expressing at specific d