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IGF-1通过JAk-STAT通路促进牙髓细增殖和分化的体外研究
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俐9年弓月≥f日
万方数据
目 录
中文摘要 1
英文摘要 4
英文缩写 8
研究论文IGF.1通过JAK.STAT通路促进牙髓细胞增殖和分化的体外 研究
前言刖舌 ..1U“··l
材料与方法 .10
结果 .20
附图 ..23
附表 .31
讨论 .32
结论 ..36
参考文献 .37
综述胰岛素样生长因子.1对人体多能干细胞生物活性的影响及机制 的研究进展 .40
致谢 .49
个人简历 .50
万方数据
中文摘要
I GF一1通过JAK-STAT通路促进牙髓细胞增殖和分化的 体外研究
摘 要
目的:通过观察JAK.STAT通路抑制剂AG490对IGF.1调控人牙髓 细胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖、矿化能力及矿化相关基因的 影响,探讨JAK.STAT通路在IGF.1促牙髓细胞增殖和分化中的作用。
方法:牙髓细胞分离培养及来源鉴定:选取因阻生或者正畸减数拔除 的健康恒牙,采用组织块酶消化法分离、提取牙髓细胞并进行原代培养, 当细胞增殖并汇合达孔底80%时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代,牙髓细 胞传至34代时,选用免疫组化法检测波形蛋白和角蛋白表达以鉴定细胞 来源。
IGF.1对人牙髓细胞增殖的影响:以3×103个/孔牙髓细胞接种于96 孔培养板中,细胞培养24h后,换无血清DMEM饥饿细胞24h,然后分 别用含2%血清浓度的5、10、25、50和100ng/ml IGF—l刺激液继续培养, 培养1d、3d、5d和7d,每3天换一次液,每;fL力H 20皿vrrr溶液,4h后 吸净培养液,每;/L,ln 1 501alDMSO溶液,酶标仪以490nm波长检测各孔吸 光度(OD)值。
IGF.1诱导牙髓细胞增殖过程中JAK.STAT通路的作用:以同样实验
条件将牙髓细胞接种于96孔板中,分5组:①对照组②空白对照组③ l OOng/ml IGF.1组@50I_tmol/L AG490+1 00ng/ml IGF.1组@50pmol/L AG490组,培养1d、3d、5d和7d采用MTT法检测细胞增殖。
碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析IGF.1对人牙髓细胞的矿化作用:
以2×105个/-TL牙髓细胞接种于6孔板中,待牙髓细胞融合至80%时,换 成以下4组矿化诱导液①矿化诱导液(Control/M)②100ng/ml IGF.1的矿 化诱导液③100ng/ml IGF一1+50pmol/L AG490的矿化诱导液廷)509mol/L AG490的矿化诱导液,分别刺激牙髓细胞7d、14d和21d,在室温下用 4%的多聚甲醛固定30rain,分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析。 茜素红染色后每孔加入lmll0%氯化十六烷基吡啶,测定562nm波长下 0D值。
万方数据
中文摘要
RT-PCR检测成牙/成骨基因mRNA的表达:在上述4组矿化诱导14d 的牙髓细胞中加入lmlTRIzol,参考TRIzol说明书提取总RNA。根据 M-MLV第一链合成系统操作说明书反转录获得单链cDNA,使用RT-PCR 检测ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA表达。
Western blot及免疫荧光法检测JAK.STAT通路JAK2蛋白磷酸化水 平:用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液RIPA将上述4组矿化诱导4h
后的牙髓细胞裂解,提取总蛋白,采用SDS.PAGE凝胶电泳,随后转至
PVDF膜,牛奶蛋白封闭后,分别孵育P.JAK2(1:1000)与GAPDH(1: 1000)一抗及抗兔IgG二抗(1:20000),最后用双色红外激光扫描仪进行 扫膜,Image J软件分析结果。将处于对数生长期的牙髓细胞消化,以t04 个/ml浓度的细胞悬液接种于六孔板中,培养24h后
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