FHC Bim相互作用在细胞凋亡中作用及φC1整合酶结构研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 摘 要 本论文分两部分，分别研究了人细胞中，促凋亡蛋白Bim与铁蛋白重链FHC 间的相互作用、FHC抗细胞凋亡的功能及①C31整合酶的高级结构初步研究。 选择性地诱导肿瘤细胞凋亡是一种重要的肿瘤基因治疗策略，而bcl-2家 族基因则是主要的靶点之一。Bim是bcl-2家族促凋亡基因之一，为一个有潜在 应用价值的细胞毒蛋白基因。但其作用的细胞调节机制依然没有充分阐明。我们 通过酵母双杂交分析鉴定可能与Bim相互作用的基因，试图对Bim在细胞凋亡中 的作用机制有更细节的了解。 铁蛋白重链FHC(Ferritin Heavy Chain)为一个酵母双杂交分析新筛选到 的Bim相互作用蛋白。FHC在机体内结合铁离子，维持铁离子代谢平衡是其己知 的重要功能。多种外源因素造成的细胞损伤的保护机制及细胞恶性转化的抗凋亡 机制中涉及它的调控。FHC也是机体对抗活性氧(reactive oxygen species，ROS) 的重要手段之一。NF-K B介导的对TNF-a诱导的细胞凋亡保护过程中，ROS是 FHC诱导的上游事件。ROS介导了NID和BIM诱导的caspase激活及相应的凋亡。 这些研究提示FHC，Bim参加了这些凋亡信号引起的ROS及随后的细胞凋亡调节。 Fhc，Bim具体是以怎样的机制参加这个过程是本课题研究试图回答的问题。 为了验证Bim和FHC的相互作用，我们在293T细胞中共表达EGFP-Bim和 RFP—FHC融合蛋白。发现两种蛋白在细胞内基本上都分布在细胞质，并且有部分 重叠分布，两种蛋白在细胞内共定位特性提示两种蛋白质相互作用的具备可能 性。进～步我们在共表达Bim和myc—FHC的细胞中，mys—FHC特异性抗体可以从 细胞裂解物中沉淀EGFP—BIM却不能沉淀GFP。MCF一7有8im L的持续较高表达， MCF一7细胞转染FHC基因情况下，通过免疫共沉淀分析证实了两者之间存在相互 作用。研究试图通过酵母交配试验鉴定了FHC、和Bim有相互作用的关键结构。 筛选提示所有含有BH3 domain的Bim异构体都可以和FHC相互作用。提示Bim BH3 domain为介导Bim，FHC相互作用的充分因素。 为了鉴定FHC、Bim相互作用的细胞生物学功能，我们共转pCMV-myc—FHC 或FHC特异性siRNA和pEGF—Bim来揭示FHC的效应。实验发现干预FHC基础 表达水平对细胞凋亡没有显著影响，但是FHC的过表达能够部分抵消Bim过表 达所导致的细胞凋亡、降低细胞FHC表达则可以增加Bim介导的细胞凋亡。为 了揭示FHC抗凋亡的细胞学机理， 我们研究了氧化压力下，FHC过表达和FHC 低调表达对氧化剂细胞毒性的影响。发现FHC 低调表达对氧化剂细胞毒性的影响。发现FHC在AD293和MCF一7中表现出对氧 化剂细胞毒作用的保护。FHC也对II_,0=存ltEK293中引发的细胞毒具有保护作用。 我们的研究确定了一个新的Bjm相互作用蛋白FHC。研究结果提示，FHC 可能参与了him介导的凋亡和氧化应激反应并起保护作用，FHC是第一个与BH3 domai rl相互作用的抗捌亡非bc]-2家族蛋白。 链霉菌噬菌体①C31整合酶可以将外源DNA序列定点整合到哺乳动物细 胞基因组特定位点上，从而极大的降低了由于外源基因随机插入造成的基因突 变风险，可以成为在哺乳动物细胞中进行转基因位点特异性重组操作和基因治 疗的有用工具。但是直到现在，对①C31整合酶结构的认识十分粗略，普遍认为 其N端为催化域，除N端的催化区之外，庞大的C一端被笼统地认为可能起识别 结合DNA底物位点的功能。也没有发现与其他重组酶有序列上的相似性，生物 信息学方法对它的二级结构的分析也未能给我们足够的截取合适片段位置的提 示。该整合酶在高等生物细胞应用的低效率和其本身功能结构数据的缺乏，依 然困绕有关研究和应用。 我们尝试培养(bC31整合酶蛋白结晶，希望能够探索它的分子结构，为底 物和功能关系研究和分子改造，及其应用提供些有益的线索。由于蛋白在晶体培 养缓冲液中的不稳定性，没有获得可以用于X-ray分析的结晶。我们又试图截取 它的片段进行结晶，并尝试和ATT底物片段的共结晶。我们用低浓度的胰酶对① C31整合酶进行部分消化后，它表现出较有规律的消化模式，出现特定的片段， 提示我们除了我们目前知道的粗略的N一端催化区及C一大序列之外，可能存在更 精细的小型功能区域。但是没能通过HPLC的方式分离到足够的单一峰，以用于质 谱分析，或用于Edman降解分析其末端的蛋白片断的，从而无从得知更精细的功 能区域的分界。 关键词：细胞凋亡， bim，铁蛋白重链FHC，蛋白质相互作用，活性氧ROS，基因 治疗，定点整