IL审审35基因染及其对小鼠免疫功能的影响.docx

天津医科人学硕+学位论文 中文摘要 目的：探讨IL．35质粒载体体内基因转染的可行性及其对小鼠免疫功能的影响。 方法：(1)鉴定格拉斯哥大学惠赠的IL．35基因表达质粒载体(pSecTa92．IL35)。 设计目的基因IL．35的上下游引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，扩增目的基 因IL．35；双酶切质粒载体，采用琼脂糖凝胶电泳法检测目的核酸片段分子量的 大小：(2)IL．35基因表达质粒载体和另一种绿荧光蛋白表达载体阳离子脂质体 转染法体外转染人肾上皮细胞系293细胞，倒置荧光显微镜观察293细胞绿荧 光表达水平评估细胞转染情况，流式细胞术(FCM)分析细胞的转染效率，酶 联免疫吸附法(ELISA)检测细胞转染后上清液中IL．35的浓度，分析IL．35基 因表达情况；(3)采用鼠尾静脉流体力学转染技术将IL-35基因表达质粒载体 和PBS缓冲液分别体内转染BALBM小鼠，流式细胞技术检测转染后小鼠外阁 血及脾脏CD4+CD8-T细胞、CD4。CD8+T细??、CD3。CDl6+NK细胞、 CD4+CD25+Treg比例；(4)利用密度梯度离心法分离纯化体内转染IL．35基因表 达质粒载体的BALB／c(II．2d)小鼠和C57BL／6(H．2b)d、鼠脾脏单个核细胞，分别以 经丝裂霉素处理的BALB／c和C57BL／6小鼠脾细胞作为刺激细胞，体内转染后 的未经丝裂霉素处理的BALB／c小鼠脾细胞作为反应细胞，进行单向混合淋巴细 胞培养，观察IL．35对培养体系细胞增殖的影响，以流式细胞技术检测培养体系 CD4℃D8叶r细胞、CD4。CD8+T细胞、CD4+CD25十Treg比例。 结果：(1)通过琼脂糖凝胶电泳的检测，目的核酸片段的分子量大小均正确；(2) 体外转染后倒置荧光显微镜可以观察到绿荧光蛋白表达，流式细胞术分析293 细胞的转染效率在35．30％，ELISA可检测到IL．35基因表达的质粒载体转染的 细胞上清液中有IL．35的表达； (3)体内转染IL．35可引起小鼠外周血及脾脏 CD4+CD25+Treg比例的上调，外周血CD4+CD8T细胞、CD3’CDl6+NK细胞比 例的下调；(4)IL．35能上调同种异体混合淋巴细胞反应体系中的CD4+CD25+Treg 水平，下调CD4+CD8T细胞比例的水平。导致这些变化的原因可能是被转染的 小鼠表达了IL．35，引起了脾脏及外周血中CD4+CD25+Treg比例的上调，增强  天津医科人学硕十学位论文 了Treg免疫调节的作用。 结论：IL．35质粒载体体内转染能涛导小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的增殖和分 化，并间接或直接抑制CD4+T细胞的活化水平，抑制NK细胞的增殖和分化， 从而对免疫移植耐受的建立产生积极的影响。 关键词：IL．35； CD4+CD25+调节性T细胞； T细胞亚群； 流体力学转染 Ⅱ  天津医科人学硕+学位论文 Abstract IL一35 gene transfection and its effect on the immune function of mice Objective：To investigate the feasibility of IL一35 in vivo gene transfection and its effect on the immune function of mice． Methods：(1)The IL-35 expression plasmid vector(pSecTa92一IL35)from Glasgow University Was characterized．Upperstream primer and downstream primer were designed and synthesized．The IL-35 gene was amplified、枷tll polymerase chain reaction(PCR)．The plasmid was aslo digested with specific restriction enzymes．The DNA fragments were determined by agarose gel electrophoresis．(2)The IL-35 expression plasmid vector or enhanced green fl uorescence protein(EGFP)expression vector were transfected into 293 cells by lipofectamine．The transfection efficiency Was determined by fluores