Fucoidan逆转人肝癌Hep2细胞EMT表型及机制研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docx

目 目 录 一、摘要 ．1 (一)中文摘要 ．1 (二)英文摘要 ．4 二、正文 ．7 (一)前言(一)刖舌 ．． 77 (二)材料与方法 ．9 1．材料 ．9 1．1细胞系 9 1．2试剂与药品 9 1．3仪器 ．10 1．4实验试剂配制 ．1 1 2．方法 ．．1 1 2．1细胞培养 ．1 1 2．2细胞活力检钡,U(MTT法) ．12 2．3划痕实验 ．13 2．4 Transwell实验 1 3 2．5免疫荧光 ．1 4 2．6 Western Blot检测相应蛋白变化 l 5 2．7 RT—PCR检测相关基因表达变化 ．．1 7 万方数据 3．统计分析 3．统计分析 ．20 (三)结果 21 1．Fucoidan对人肝癌细胞HepG2活力的影响 ．21 2．Fucoidan对细胞迁移能力的影响 ．．21 3．Fucoidan对细胞形态和EMT标志物表达的影响 22 4．Fucoidan对Snail表达及核转位的影响 24 5．Fucoidan对Snail上游核转录因子的影响 24 6．Fucoidan对TGF．[3／Smads信号通路的影响 25 7．Fucoidan对P13K／AKT信号通路的影响 ．26 (四)讨论 ．．27 (五)结论 ．30 (六)参考文献 ．31 三、综述 36 (一)综述 ．36 (二)参考文献 ．44 四、攻读学位期间发表文章情况 51 五、致谢 ．52 万方数据 大连医科大学硕士学位论文Fuco 大连医科大学硕士学位论文 Fuco i dan逆转人肝癌HepG2细胞EMT表型及机制研究 硕士研究生：刘尊东 指导教师：邹向阳教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 目的：上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)是指上皮 细胞在特定情况下失去其极性向间质细胞表型转变的过程，其特点为细胞粘附性 下降或消失，极性丧失，细胞运动能力和转移能力增强。在近十年研究中发现EMT 在肿瘤和组织纤维化等病理改变中也会出现。EMT发生表现为上皮标志物 E．cadherin等表达的减弱或缺失，而间质标志物Vimentin等表达增强以及一系列信 号通路的异常激活。Snail为EMT主要核转录因子，能够促进肿瘤细胞EMT的发 生及发展，在EMT过程当中，Snail可以直接参与诱导Vimentin的生成而抑制 E．cadherin的生成。TGF．p相关信号通路为促进Snail生成的重要信号通路，TGF．p 信号通路的异常活化被视为肿瘤细胞EMT发生的开端。因此，靶向TGF．]B／Snail 信号轴及Snail合成与核转位的药物的研发，对于抗肿瘤细胞EMT现象和肿瘤复 发具有重要意义。 多糖类广泛存在于动物、植物和微生物中，对机体多种生理过程具有调节作 用。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是一种富含L．岩藻糖和硫酸根基团的酸性杂多糖， 其中硫酸根基团是其主要功能基团。Fucoidan是海洋褐藻类植物的重要生物活性 物质，Fucoidan具有免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒和防辐射等多种药理活 性。在本实验室前期工作中从裙带菜孢子叶中提取的Fucoidan具有高含量的硫酸 根基团，因此具有更强的生物学活性。 本实验以人肝癌细胞系HepG2细胞为基础，采用细胞生物学，生物化学以及 分子生物学等方法，探究Fucoidan能否逆转HepG2细胞EMT表型及探究可能的 分子机制。 方法： 1．采用MTT法，检测Fucoidan对肿瘤细胞活力的影响。 万方数据 大连医科大学硕士学位论文2．运用划痕实验及transwell方法，检测Fucoidan对肿瘤细胞迁移的影响。 大连医科大学硕士学位论文 2．运用划痕实验及transwell方法，检测Fucoidan对肿瘤细胞迁移的影响。 3．免疫荧光法，检测Fucoidan对肿瘤细胞膜、细胞骨架的影响。 4．Western．blot和Real．Time PCR法，检测Fucoidan对肿瘤细胞EMT标志蛋白 Vimentin、E．cadherin表达的影响。 5．采用免疫荧光、Western．blot和Real．Time PCR方法，检测Fucoidan对Snail蛋白 的表达及核移位的影响。 6．采用Western．blot方法，检测Fucoidan对Snail上游主要核转录因子HMGA2、 HIF．1 0【和NF．vd3的影响。 7．采用Western．blot方法，检测Fucoidan对促进Snail生成主要通路TGF．13／Smads 信号通路相关蛋白TGFR II，Smad2／3和Smad4的影响。 8．采用Westem．blot方法，检测对影响Snail稳定性及核移位的信号通路 P13刚AKT／