Kruppel样因子8过上调FLT1促进769P肾癌细胞株体外增殖.docx

解放军医学院硕士学位论文Kruppel样因子8通过上调FLTl促进769．P肾癌细胞株体外 解放军医学院硕士学位论文 Kruppel样因子8通过上调FLTl促进769．P肾癌细胞株体外 增殖 中文摘要 目的：在肾透明细胞癌细胞系786．0细胞株中瞬时敲低Kruppel样因子8(Kruppel like factor 8，KLF8)的表达能够抑制786—0细胞系的增值，但KLF8在肾癌中的作 用机制并不清楚，既往的研究表明，在肾癌中VHL突变导致的VEGF／VEGFR、 PDGFIB／PAGFRl3、TGF／EGFR过度激活，在肾癌的发生发展中起重要作用，本研 究旨在探讨过表达KL8基因对肾透细胞癌细胞系769．P的增值能力的影响，以及 该作用是否与上述经典通路有关，其作用靶点是什么。 方法：应用慢病毒包装系统构建重组KLF8质粒，与空载体质粒分别转柒293V细 胞进行病毒包装，再分别感染769．P细胞株，利用实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)及Western blot技术检测769．P细胞KLF8的表达情况。根据769．P细胞感 染重组KLF8慢病毒或空载体将其分为两组进行功能实验，用平板克隆实验及MTS 方法检测769．P细胞增殖能力的变化，应用流式细胞学技术检测细胞周期变化。应 用Westernblot技术检测潜在靶基因在过表达KLF8组和转染空质粒组中的表达情 况。应用siRNA(small interference RNA)技术敲低FLTl后根据FLTl蛋白表达 量筛选出敲低效果最明显的siRNA。分别在转染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8质粒和 pLV-EGFP(2A)Puro空载体质粒的769-P细胞中转染siFLTl，再应用平板克隆实验， MTS实验检测769．P细胞株增殖能力的变化。 结果：①成功筛选出高表达KLF8基因的769．P细胞株，转染pLV-EGFP(2A) Puro．KLF8组的KLF8蛋白表达较对照组显著上调。②平板克隆实验：转染 pLV-EGFP(2A)Puro．KLF8组较空载体组克隆数明显增多(P0．05)。@MTS实验， 在48h、72h、96h的检测中，实验组在490nm吸光值显著升高(Po．05)。④流式细 胞学检测细胞周期，转染pLV-EGFP(2A)Puro．KLF8组Go／G1细胞比例明显减少S 期细胞比例增加。@Western blot检测发现FLTl在实验组中表达显著上升。⑥应 用siFLTl敲低FLTl后，769一P细胞株的增值能力明显下降，平板克隆实验： 769P—KLF8+control克隆数最多，769P．KLF8+siFLTl与769P．EMPTY+control组次 之．769．P．EMPTY+siFLl’1克隆数最少；MTS：769P．KLF8+control组于72h，96h 万方数据 解放军医学院硕士学位论文时间点在490nm处光吸收值最高，769P-KLF8+siFLTl与769P-EMPTY+control组次 解放军医学院硕士学位论文 时间点在490nm处光吸收值最高，769P-KLF8+siFLTl与769P-EMPTY+control组次 之，769-P-EMPTY+siFU’1最低(PO．05)。 结论：KLF8基因过表达能够促进肾透明细胞癌细胞系769．P的增值，并且该增值 效应依赖于FLTl(即VEGFRl)的表达升高。 【关键词】Kruppel样因子8；肾透明细胞癌；调控机制 2 万方数据 解放军医学院硕士学位论文Kruppel·-like 解放军医学院硕士学位论文 Kruppel·-like factor 8 Promote Renal Carcinoma Cell Line 769一P Proliferation through Up—regulate FLTl in vitro Abstract objective：Knockdown ofKLF8 call inhibit the proliferation of 786一O cell line，but the effect of its overexpression in the human renal carcinoma cell remains unclear, especially the important VEGF／VEGFR signal pathway．So we plan to overexpress KLF8 in 769-P cell line through construct recombinant lentiviral vector pLV-EGFP(2A) Puro·KLF8．And research its re