GCSF动员后CD4T胞S1PS1P受体信号变化及S1P5在LFA1粘附功能中的作用.docx

军医进修学院解放军总医院 博士学位论文 G-CSF动员后CD4+T细胞S1P/S1P受体信号变化及S1P5在LFA-1粘 附功能中的作用 姓名：李猛 申请学位级别：博士 专业：内科学（血液病学） 指导教师：高春记军医进修学院博．卜学位论文S1P5在LFA．1粘附功能中的作用 军医进修学院博．卜学位论文 S1P5在LFA．1粘附功能中的作用 中文摘要 背景和目的：粒细胞集落刺激因子(G．CsF)具有免疫调节作用。淋巴细 胞功能相关抗原l(LFA．1)不仅介导细胞间粘附，还可影响淋巴细胞免疫功能． 1磷酸鞘氨醇(S1P)既可以作为胞内第二信使，又可以作为细胞间信号分子通 过与受体结合而发挥作用．我们前期研究发现G．CSF动员后CD41细胞U排l 粘附力下降，并使CD4+T细胞免疫功能改变，可能影响急性移植物抗宿主病的 发生；G．cSF动员不改变供者血清的S1P浓度，但增强单核细胞内s1P限速酶 S砷K的活性．结合文献报道SlP可以增强LI’A．1的粘附力，SlP拮抗剂通过 LFA．1和p7整合素增加淋巴细胞归巢．因此，我们推断动员后SlP／slP受体信 号可能也参与了G．csF免疫调节网络．本研究通过分析G-CsF动员前后 SlP／S1P受体信号的变化、SlP5对U’A．1粘附功能的影响以及CD41细胞 G．csF受体表达情况，研究探讨s1P／s1P受体信号在GcsF诱导免疫耐受中的 作用． 方法：(1)采用RealtiIIle RT．PCR和流式细胞术检测G．CSF动员前后SlP 受体在mRNA和蛋白水平的表达变化：采用Transwell趋化实验检测GCSF动 员前后C晰细胞对S1P趋化作用的变化；采用粘附实验检测S1P对动员后 CD4+T细胞U’A．1粘附能力的影响；采用wbstenl blot的方法检测G．CsF动员 前后CD4+T细胞LFA-1磷酸化状态的变化．(2)在Jurkat细胞系中，用洛伐他 汀抑制LFA．1信号，用CCK_8法检测抑制LFA．1后细胞增殖，PI和趾mexinV 检测细胞凋亡，用Rcaltime RT-PCR检测S1P5表达变化；采用SiRNA转染沉 默Jurkat细胞SlP5，观察SlP5对J叫【at细胞增殖、凋亡以及对LFA．1磷酸化 和粘附能力的影响。(3)为研究G．CsF是否可直接通过受体调节CD4+T细胞功 能，我们采用刀豆蛋白诱导cD4+T细胞活化，用流式细胞术检测动员前后G．CSF 受体的表达变化；CcK-8法检测体外G．csF对CD4+T细胞及Jurkat细胞增殖 的影响． 结果：(1)G．csF动员后cD4+T细胞的5种S1P受体，在mRNA水平上， S1P5表达较动员前上调，S1P1．s1P4表达无明显差异；在蛋白水平上，S1P5在 军医进修学院博．卜学位论文动员后CD4+T细胞，CD8+T细胞、NK细胞中表达均上调，其中CD4+T细胞变 军医进修学院博．卜学位论文 动员后CD4+T细胞，CD8+T细胞、NK细胞中表达均上调，其中CD4+T细胞变 化幅度最大；动员后CD4+T细胞对SlP的迁移率较动员前下降；SlP不影响动 员前CD4+T细胞U、A．1粘附率，但可降低动员后的CD4+T细胞U’A．1粘附率； G．CsF动员后CD4+T细胞U’A．1磷酸化降低．(2)抑制LFA．1可抑制细胞系 Jurkat和l为62细胞增殖、诱导凋亡，并减少J删kat细胞s1P5的表达。沉默Jurkat 细胞S1P5基因后，对Jurkat细胞增殖。凋亡以及u’A．1磷酸化均无明显影响， 但可促进u’A．1粘附能力。(3)供者cD41细胞在动员前后均有G．csF受体 n则A表达；G．CsF动员可抑制CD4+T细胞G．CsF受体表达；G．CsF体内、 体外均可抑制刀豆蛋白诱导的CD4+T细胞增殖反应；G．CsF对CD4+细胞系 Jurkat细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性． 结论：G．CSF动员后CD锕细胞S1P5表达增加，可能导致CD秆细胞对 slP趋化减弱并降低LFA．1的粘附能力．SlP5可能是U’A．1粘附能力的负调控 因素．G-CsF可能通过其受体直接调节CD4+T细胞功能． 关键词：粒细胞集落刺激因子；淋巴细胞功能相关抗原l；l磷酸鞘氨醇； 粘附；动员 军医进修学院博l：学位论文The 军医进修学院博l：学位论文 The Change of S1P／SlP Receptor Signal 0f CD4+T CeU after G．CSF Mobilization and the Role of S1P5 on LFA—l Adhesion Abstract Background a11d aims： G瑚11locyte c010ny-stimulating Facto