MiR124通过靶向PRX1调节结直肠癌辐射敏感性.docx

硕士学位论文 方法： 1．结直肠癌细胞和癌旁组织中miR-124表达检测 人结直肠癌细胞系SW480、LOVO、SW620、HCT-116、HT-29、LST-174 和人正常结直肠粘膜细胞FHC均购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞 库。全部人结直肠癌组织样本均取自南方医科大学南方医院2010年至2014年 普通外科手术标本，对照组取至少离肿瘤至少5cm以上的正常结直肠组织，所 有样本均未接受过放疗、化疗和其他抗肿瘤治疗，最终由病理判断确诊为结直 肠癌。 采用TRIZOL法裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀的方法提取结直肠癌细胞和组 织标本总RNA。按照Thermo Fisher Scientific逆转录试剂盒说明书操作，逆转录合 成cDNA后，用实时定量PCR实时检测miR．124在不同的结直肠癌细胞和组织中 表达水平的变化，再进行统计分析。 2．细胞辐射敏感性的检测 2．1．建立稳定过表达miR-124的结直肠癌细胞株 LV．miR—124和LV．con慢病毒上清分别转染细胞系SW480、LOVO，随后采 用流式细胞仪分选GFP+细胞，得到稳定过表达miR一124的结直肠癌细胞系。 2．2．过表达miR．124不同剂量辐射下细胞存活分数 取处于对数生长期的未处理和稳定过表达miR．124的结直肠癌细胞系 SW480、LOVO接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别给予0、2、4、6、8、10 Gy 的X线照射(用Varian 600C力U速器6Mv_x线，SSD为100 em)。每个剂量点设3个平 行重复样本，照射后常规培养2周后，用4％多聚甲醛固定、吉姆萨染色。将低 倍显微镜下计算出各种细胞的克隆数(细胞数50个为1个有效克隆)，采用 GraphPadPrism5．0软件进行“多靶单击模型(Multitarget．single hitting)”拟合细 胞存活曲线，获得D0、Dq、SF2等放射敏感参数。 2．3．过表达miR-124的细胞系不同剂量辐射下凋亡相关蛋白的检测 取对数生长期的未处理和稳定过表达miR．124的结直肠癌细胞系SW480、 111 万方数据  摘要 LOVO细胞，辐射后6h提取细胞总蛋白，Western blot检测上述细胞的凋亡相关 蛋白Bcl．2、caspase．3和磷酸化的v．H2AX的变化。 3．miR．124调控结直肠癌细胞辐射敏感性的分子机制 3．1生物倍息学预测miR一124下游调控靶基因 利用生物信息学预测软件targetscanhuman6．0(虢艟型堕娶型：垒鳐煎氍堂型)和 常用miRNA数据库TargetScan和Pictar对miR一]241，拘靶基因进行预测分析，按照软 件操作流程预测miR一124下游调控的靶基因，并通过文献筛选，最终选定PRRXl 作为下一步研究的目标。 3．2荧光素酶报告系统验证PRRXI是miR．124的靶基因 构建miR．124预测结合位点的PRRXl基因3’非编码区(YUTR)以及突变型 PRRXl的3’非编码区的荧光素酶报告质粒，获得pLUC．3’UTR．PRRXI以及 pLUC．3’UTR-mut．PRRXl荧光素报告质粒，用于后面的共转染和荧光素酶报告基 冈检测，将pLUC一3’UTR—PRRX 1以及pLUC．3’UTR—mut—PRRX 1荧光素报告质粒和 miR．124mimics及inhibitors共转染，采用Promega公司Dual．Luciferase报告基因检 测系统进行荧光素酶活性检测，所有实验重复3次和统计学分析。 3．3干扰PRRXI对结直肠癌细胞辐射敏感性 LV．PRRXl和对照LV．shcon慢病毒悬液分别感染结直肠癌细胞，随后通 过流式细胞仪分选GFP+细胞，得到稳定干扰PRRXl的细胞。将细胞分不同剂 量进行照射，计算克隆形成率和分析存活分数，运用GraphPad Prism 5．0软件进 行“多靶单击模型(Multitarget-single hitting)”曲线拟合分析。 3．4过表达PRRXI可以逆转miR．124对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响 依据阳离子脂质体法将pCDNA3．1一PRXXl质粒转染至己构建的稳定过表达 miR．124的结直肠癌细胞中。48h后Western blot检测转染效率，将细胞分不同 剂量不同组进行照射，克隆形成实验反应细胞辐射敏感性的变化。克隆形成率 以及存活分数运用GraphPad Prism 5．0软件进行“多靶单击模型”曲线拟合，并且 Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl一2、caspase一3和磷酸化的7-H2AX的变化。 万方数据  硕士学位论文 3．5动物实验 在体内环境下观察miR．1 24对结直肠癌辐射敏感性的影响。取出的肿瘤组 织并测量大