miR155p在食管鳞癌中的表达及功能.docx

硕士学位论文殖、凋亡和迁移中的作用。 硕士学位论文 殖、凋亡和迁移中的作用。 研究方法 1、标本收集 收集2014年12月到2015年6月在上海奉贤区中心医院和上海仁济医院胸 外科手术切除的20例食管鳞癌组织及其邻近食管正常组织距病变部位5 cm以上 标本。患者年龄为43．74岁，平均年龄为58岁。所有患者术前均未进行任何化 疗、放疗，且术前检查均未发现淋巴结转移及远处转移。患者行食管癌根治术后， 从手术切除的食管癌组织中留取肿瘤标本(避免取肿瘤坏死区)，同时在距肿瘤边 缘5 cnl处留取正常食管组织作为癌旁组织，所有标本均在液氮罐中冻存。20例 食管鳞癌标本最终病理诊断均为食管鳞癌(ESCC)。 2、细胞培养 人食管鳞癌Ecal09细胞购自中科院细胞库，用含lO％d、牛血清及1％双抗 的RPMll640培养基，在37。C，5％C02培养箱中培养。待细胞融合度达到 70—80％，用0．25％胰酶37。C消化10分钟，进行细胞传代或分组实验。 3、实时荧光定量qPCR检测组织miR-155—5p的表达水平 提取细胞总RNA，检测RNA质量和浓度。采用特异性U6内参反转录引 物及miR一155．5p反转录引物及参照miRNA cDNA Synthesis kit试剂盒说明书进 行反转录。采用qPCR检测miR．155．5p的表达情况。 4、细胞转染 miR一155．5p类似物mimic、抑制剂inhibitor及阴性对照(mimic-NC、 inhibitor-NC)由广州锐博生物科技有限公司设计合成，转染试剂 LipofectamineTM 2000购自于美国Invitrogen公司。我们将人食管鳞癌Ecal 09 细胞分为五组，分别如下：miR-55—5p mimic类似物(Lipofectamine2000+miR一55—5p mimic)；NC(mimic)阴性对照组(Lipofectamine2000+NC(mimic))；miR-5 5—5p inhibitor抑制物组(Lipofectamine2000+miR-55—5p inhibitor)；NC(inhibitor)阴性对 III 万方数据 摘要N组(Lipofectamine2000+NC(inhibitor))；未转染空白对照组Blank组(仅加同等 摘要 N组(Lipofectamine2000+NC(inhibitor))；未转染空白对照组Blank组(仅加同等 量Lipofectamine2000脂质体)。转染前在6孔板中种植人食管鳞癌Ecal 09细胞， 待细胞达到70-．80％融合时按转染说明书进行操作。 5、实时荧光定量qPCR法检测转染后ECl09细胞中miR-155-一5p的表达水平 收集4中转染24 h后的各组细胞，按qPCR试剂盒说明书进行检测和分析 各组细胞中miR．155．5p的表达水平。 6、细胞增殖买验(CCK8) 我们将人食管鳞癌Ecal09细胞分为五组。收集转染6 h后的各组细胞，接 种于96孔板中，分别继续培养1，2，3d后，实验参照CCK8试剂盒说明书， 在酶联免疫检测仪上读取450 nm波长处各孔的吸光度(OD)值。 7、细胞凋亡实验(AnnexinV-PI双染法) 我们将人食管鳞癌Ecal09细胞分为五组。收集转染24 h后的食管鳞癌 Ecal09细胞，以1000 r／rain离心5 min收集(1—5)X 105个细胞，实验参照 AnnexinV-PI试剂盒说明书，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。 8、细胞划痕实验 我们将人食管鳞癌Ecal09细胞分为五组。将Ecal09细胞接种至6孔板中， 转染24 h后用枪头在6孔板中划痕，用无血清培养基洗涤去掉脱落细胞，加入 无血清RPMI．1640培养基，于37。C、5％C02继续培养。分别在划痕后0，24 h 拍照，观察划痕愈合能力。 9、统计学方法 定量qPCR验证检测出有表达差异的miRNA，以达到阂值Ct值的最低循环 数计算样本中miRNA的RNA拷贝数相对量。其相对表达量计算公式是2一△ Ct和2．△△Ct表示，其中ACt=Ct目的．Ct内参U6，△ACt=Ct癌组织一Ct癌 旁组织。2一△△Ct代表癌组织与配对癌旁组织中的目的基因RNA拷贝数的比 值。呈正态分布的配对资料用配对t．检验，呈非正态分布的配对资料用秩和检 验，多组间的均数比较用单因素方差分析。用SPSSl7．0软件来进行统计学分析， p0．05为差异有统计学意义。 IV 万方数据 硕士学位论文结果 硕士学位论文 结果 1、食管鳞癌组织中miR-155-5p的表达水平高于癌旁组织。 利用qPCR法对20例食管鳞癌组织及其相应癌旁组织中miR．155—5p的表达 水平进行检测。以癌旁组织中