miR26a和miR30c协同调控TGFβ1诱导肾小管上皮细胞转分化在糖尿病肾病中的作用机制研究.docx

舢㈣川㈣舢Ⅲ洲帅llfff《 Y31 1 6983 博士学位论文 miR-26a和miR-30c协同调控TGFpl诱导 肾小管上皮细胞转分化在糖尿病肾脏病中 的作用机制研究 博士研究生：郑宗基 指导老师：薛耀明教授 摘要 研究背景和目的 糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病患者常见的慢性微血 管并发症，其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升，已成为终末期肾病的 主要原因，DKD的防治也成为内分泌科和肾脏科医师面临的难题之一。然而该 病的发病机制迄今尚未完全阐明， 既往认为DKD的早期病变部位主要在肾小 球，近年来的研究发现肾小管病变无论从发病时间或发病机制看均有其独立性， 并且肾小管病变及l肾问质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功 能的相关性更为密切，故’肾小管问质纤维化的发生机制越来越受到人们重视。 ’肾间质纤维化是DKD的重要的病理特征，表现为细胞外基质(ECM)的 沉积，主要包括胶原和纤连蛋白沉积。肌成纤维细胞是产生ECM的重要来源。 肾小管上皮细胞在病理条件下失去上皮细胞的特性而获得肌成纤维细胞的特性， 转化为间质肌成纤维细胞的过程称为上皮间质转化(EMT)。研究表明肾小管 上皮细胞转分化是肌成纤维细胞的重要来源，且在糖尿病肾脏病的发生和发展 中起重要的作用。阻止EMT可能是延缓小管间质损伤进展的主要措施。因此 进一步寻求阻断肾小管上皮细胞损伤及肾间质纤维化作用的手段，将是今后研 究防止DKD持续进展和保护肾功能的重要目标。 万方数据  摘要 微小RNA(miRNA)是长约22个碱基的短链非编码RNA，它通过与靶基因 的3’非翻译区(3’UTR)结合，使靶基因沉默或者降解，起到转录后调节靶基 因的表达的作用。目前已经发现了超过2000种人类的miRNA，以及超过60％ 的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控。因此miRNA靶向调控大量的基因， 从而参与了众多疾病发生和发展的过程。 近年来的研究表明，miR-26和miR．30家族在多器官组织的纤维化、凋亡 等病理生理进程中发挥重要的作用。在特发性肺纤维化细胞模型中，miR．26a 通过抑制靶基因Lin28B进而调控let一7d的表达，从而抑制肺纤维化。NF．v,B 调控miR一26a的表达，而miR．26a进一步靶向调控C01．I和CTGF，从而缓解心 肌纤维化。在猪肾血管疾病模型中，通过原位杂交技术发现miR．26a主要表达 在肾小管细胞中，且在肾血管疾病模型中表达显著降低，同时抑制miR-26a则 可诱导肾小管上皮细胞凋亡和调节促凋亡蛋白表达。miR．133和miR-30c均通 过抑制靶基因CTGF从而缓解了，tL,肌纤维化。miR．30通过靶作用于Notchl和 p53从而抑制足细胞损伤。但是在糖尿病。肾脏病肾纤维化，尤其是在肾小管上 皮细胞EMT进程中，miR-26a和miR-30c的研究较少，因此本研究旨在探索 miR．26a和miR．30c在糖尿病’肾脏病肾小管上皮细胞EMT中的作用以及具体机 制。 最近研究表明miRNA不但可以调控多个基因，多个miRNA也可以同时调 控一个基因的表达，形成一张复杂的调控网络，从而更加精确地对机体进行调 控。然而，目前在miRNA领域，大多数研究探索单一miRNA对单一靶点的影 响，近年来，多个miRNA协同靶作用于一个基因和单一miRNA同时调控多个 靶点正在成为热点，比如在乳腺癌中，miR．143和miR．145协同调控靶基因 ERBB3从而抑制细胞增殖和侵袭。此外，miR一455同时靶作用于Necdin、 Runxltl和HIFlan三个转录因子，从而调控棕色脂肪细胞的分化。目前在 DKD领域，探索多个miRNA协同参与糖尿病肾脏病的研究较少。本研究致力 于探索miR．26a和miR．30c是否能分别调控糖尿病肾脏病的进展，同时探索 II 万方数据  博士学位论文 miR一26a和miR．30c是否具有协同作用。首先，我们使用TGF[31(10ng／m1)刺 激肾小管上皮细胞(NRK．52E)，比较miR-26a与miR．30c以及纤维化相关基 因的表达，同时我们检测了40周龄OLETF大鼠皮质中miR-26a与miR-30c的 表达，进一步在体内验证miR．26a、miR．30c与DKD的关系；通过生物信息学 方法，我们预测miR-26a和miR．30c均靶作用于CTGF，同时预测Snaill为 miR．30c的靶基因，并且进行荧光素酶报告基因实验证明假设；接下来我们在 NRK．52E细胞中分别和同时过表达或敲除miR．26a与miR．30c，探索miR．26a 与miR一30c是否协同作用于肾小管上皮细胞EMT。机制部分，我们进一步探索 miR．26a与