miR335在肿瘤组织中的表达及其对颈癌增殖 转移的影响.docx

硕士学位论文 等多种生物学行为的检测，揭示miR．335在宫颈癌的发生发展中的作用。本课 题的研究成果将为后期深入研究miR．335在肿瘤中的调控机制提供新的方向和 思路。并加深我们对宫颈癌发病机制的了解，为寻找新的诊断、治疗宫颈癌的 潜在靶点提供新线索。 方法： 1．从miRNA分子数据库miRBase中查找miR．335在多个物种中的成熟序 列，并进行序列比对分析，根据各物种miR．335的碱基序列相似程度分 析miR．335在物种中的保守性。 2．从NCBI数据库GEO中检索常见肿瘤疾病miRNA表达谱芯片数据集， 选择包含肿瘤组织与癌旁组织分组并有miR．335表达数据的数据集作为 后续研究数据集。将数据集导入芯片数据分析软件Qlucore Omics Explorer(QOE)3．0，对数据进行标准化处理，选择适当统计学检验方法 筛选差异表达miRNA，并进一步分析miR．335各肿瘤组织中的表达水平。 3．分别在DIANA．microT、PicTar、miRDB和TargetScan等在线预测miR．335 的靶基因，取各个预测结果交集。查询miRTarBase及文献报道中经实验 验证的靶基因，与预测靶基因取并集作为后续分析的miR．335靶基因集 合。 4．在线使用DAVID上传miR．335靶基因集合，选择人类全基因组为背景， 对其靶基因集合进行功能富集分析(GO．analysis)和信号转导通路富集分 析(KEGG Pathway analysis)。 5．在生物信息学分析的基础之上，选取宫颈癌为后期研究对象。首先搜集 19组病理学确诊为宫颈癌的患者宫颈癌组织及癌旁组织制成的石蜡切片， 采用qRT-PCR实验检测这19组宫颈癌及癌旁组织石蜡切片中miR-335 表达量，并对检测结果进行统计学分析比较miR．335在宫颈癌及其癌旁 组织的表达水平差异。 6．在得到miR．335在宫颈癌及其癌旁组织的表达水平差异后，结合生物信 息学分析结果，选取宫颈癌HeLa细胞作为后续体外实验对象，研究 miR．335宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响。宫颈癌HeLa细胞分别转 III 万方数据  摘要 染化学合成的miR．335模拟物miR．335 mimics和miR．335模拟物抑制物 miR．335 inhibitor及其对照组mimics NC和inhibitors NC，达到上调或下 调miR．335表达水平目???。同时使用FAM标记的miRNA转染HeLa细 胞作为阴性对照组，初步观察转染效率。通过qRT-PCR实验检测转染后 的HeLa细胞中miR．335表达量变化进一步验证细胞的转染效果。 7．HeLa细胞转染后通过CCK8实验检测各组细胞的OD值变化，反映细胞 的增值能力；通过细胞流式检测各组细胞的周期分布变化。讨论miR．335 高表达或低表达后对HeLa细胞增殖的影响。 8．HeLa细胞转染后通过Transwell实验侵袭实验和迁移实验检测各组细胞 侵袭或迁移的细胞数，反映细胞的侵袭和迁移能力；通过细胞划痕实验 检测各组细胞在24h，48h的迁移率，反映细胞的迁移能力。讨论miR．335 高表达或低表达后对HeLa细胞侵袭和迁移的影响。 结果： 1．在miRBase中共查询到大鼠、小鼠、家犬等12个物种中的成熟序列，通 过序列比对发现在这12个物种中miR．335的碱基序列高度相似，说明 miR．335在物种间具有高度的保守性。 2．根据检索条件，从GEO中获得了肝癌(GSE31383)、肺癌(GSE48414)、 乳腺癌(GSE38167)、肝内胆管癌(GSE53870)、脂肪肉瘤(GSE45364)、 宫颈癌数据集(GSE303656)共6个符合要求的miRNA表达谱芯片数据 集。将数据集导入Qlucore Omics Explorer(QOE)3．0分析发现，miR．335 在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝内胆管癌、脂肪肉瘤肿瘤组织中的表达均与 癌旁组织存在表达差异，且表达水平均为下调，差异倍数分别为O．32、 0．07、0．19、0．93、0．58，差异均有统计学意义(P0．05)；miR．335在 宫颈癌组织中亦存在表达差异，但表达水平呈上调趋势，差异倍数分别 为1．10，差异有统计学意义(P0．05)。 3．使用DIANA．microT、PicTar、miRDB和TargetScan在线网站预测miR．335 靶基因，所得靶基因数目分别为166、137、251和2308个，这些靶基因 取交集共有8个。在miRecords中查询经实验验证和PubMed相关文献中 IV 万方数据  硕士学位论文 经证实的miR．335靶基因分别为15个、20个。三者结果取并集共有34 个靶基因作为后续研究。