hBMP2和hFGF2双基因共表达重组腺病毒载体构建及鉴定.docx

广东医学院 硕士学位论文 hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 姓名：刘思景 申请学位级别：硕士 专业：@ 指导教师：郭伟韬 201005 hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建 及鉴定 中文摘要 【目的】 构建人骨形态发生蛋白2 m瞰啪bone删哪)hog髓而c pm钯酢2，hB砌-2)和人 成纤维细胞生长因子2彻珊觚fib袖last朗)、砒自咖r．2，hFGF-2)双基因共表达重 组腺病毒载体，并对其鉴定，为后续基因治疗和细胞移植实验提供实验基础。 【方法】 通过引入内部核糖体进入位点序列(砷舶讨幽鲫鹏咖s娩，眦S)，采用 基于九噬菌体位点特异性重组系统的Q眙wa∥伽技术构建带有hB御．2和 hFGF·2双基因共表达重组腺病毒载体。用聚合酶链式反应(polyl蝴chain 豫厕册，PCR)方法扩增hBMP．2和hFGF．2目的基因，将两个基因亚克隆至 p琢匠S2．EGFP中，构建邮MP2-琢正S城7G．F2，菌落PCR、双酶切电泳及测序鉴 定。通过BP反应将hBMP2．Ⅱ冱S．hFGF2重组到载体p￡H3Nl也21中，再通过LR 反应将其转移到腺病毒载体∥岫／CMVⅣ5．DEST中。测序鉴定重组成功后将其 线性化，脂质体转染线性化的重组腺病毒载体于293细胞以包装制备重组腺病 毒Ad-hBMP2．Il冱S．hFGF2。重组腺病毒经PCR鉴定之后反复感染293细胞进 一步扩增并纯化。通过免疫法测定腺病毒滴度。 【结果】 成功扩增出hBMP．2和hFGF-2基因片段，phBMP2．琢正S枷PGF2经菌落PCR、 双酶切及测序鉴定正确。提取重组腺病毒基因组成功扩增出外源目的基因 hBMP-2和hFGF．2片段，重组腺病毒在293细胞中包装成功，获得成熟的病毒 颗粒，测得病毒滴度为2．82×101岫。 【结论】 【结论】 成功构建携带hBMP-2和hFGF．2双基因共表达重组腺病毒载体，收获的病 毒具有较高滴度，为以后利用腺病毒载体进行hBMP．2及hFGF-2双基因共表达 干预骨修复的体外及体内研究提供实验基础。 【关键词】 人骨形态发生蛋白2；人成纤维细胞生长因子2；腺病毒载体；内部核糖体 进入位点序列。 2 Construction Construction and identi矗cation of recombinant adent丽rus Vector co-expIIessing hBA们睢2 and hFGF-2 genes 【obj佻倚嘴】T0伽ls嘲me舢mbin碰础枷v∞铆渺exp煅s她llB凇and hFGF2 g饥esandt0豫诹me鲥矧舢mbin觚鸭∞鹪屯0layaf0嘁蜥∞for恤 跚b∞q啪t ge鹏t11e婶y锄d∞Il蛔nspl锄蜘0f锄砌懿联痂nents． 【Me伍ods】 T0 cc咄删the坞cOmb硫副Ic|加咖s w}cl册∞吒x衅ssing h】弧肛，2锄d hFGF2 g锄陷dqpelldh唱∞iI此mal rib0鲫m咖si屯e(眦S)暇lll髓∞by九 ph嬲ge-s沁speci舭玎渤mbhlati蛆蹈Stcms．m hBⅧ．2锄d hFGF-2 ga螂袱鹏 锄pli6ed by PCR and砌，cl伽ed in的me幽醐谢pⅡ也S2-EGFP锄d也e p11BMP2．琢匝S坷GF2 pl鲫mid w潞0b切Iined．’Ik pl锄id w弱俩丘ed b，r∞l∞y PCKdouble digesti∞锄d嘣lue批啦．It w船gubcl∞ed i咖呻V∞衄p￡舢2l by BP麟娟∞锄d subc妇树int0则删5-DEST Vec瞬by LR暇№触凹 being v砌ed by∞qu锄c吣，thc∞com蛐ad伽【o、，inIs ve咖r pl；嘲面d w弱 lin∞此E砷ed锄d由ms诧∞ed int0 293∞lls by Hpofect鲫曲舱f-0r p习ucl【aging．The 坞combi】嗯nt鲥蛔的vinls we他fIlrth盱锄叩li矗caled锄d p耐丘ed 加 PCR ide砸氖洳．啊硷丘nal virIls plo‘lu幽嗍tit髓脚by i珏皿mni勿蝠on 【R鹪u№】 1k hBMP．2粕d hFGF．2 gen豁we愆飘Jcc销sfIllly锄plified by PC1k hBMP2．Ⅱ通S制FGF2cutting趾d踟燃吣．m嗽删访邶脯删byplj枷d w瑟cO栅．衄1ed by col册y PCRdouble册d∞：ucl朗∞ PCR ofexogen沁