HIF1通过FOXO1清除胰腺癌细胞内RO的体内外研究.docx

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 众所周知，胰腺癌是一种消化系统高度恶性的肿瘤，5年生存率小于5％。 尽管外科手术和化疗有了很大的改进，但近20年来胰腺癌患者的预后并未有明 显的改善，手术切除的患者生存率仅为17％。因此，更加全面深入地了解胰腺 癌的发生发展机制及其内在的分子生物学特性，寻找积极的诊治手段，探索有 效的治疗靶点成为多年来胰腺癌研究的焦点问题。很多资料显示胰腺癌组织中 缺氧诱导因子．1et(Hypoxia inducible factor-I，HIF．1a)的表达与预后密切相关，其 蛋白表达强弱与淋巴结转移及临床分期等正相关，因此HIF．1Gt可能做为新的胰 腺癌治疗靶点。 ROS(Reactive Oxygen Species)包括超氧阴离子自由基、H202、次氯酸盐、 羟自由基等，是线粒体氧化磷酸化过程中电子呼吸传导链有氧代谢过程中产生 的副产品。适量的ROS可通过激活促增长转录因子(c—fos和cjun)、促进肿瘤 细胞的存活；但如果ROS过度累积，可以引起肿瘤细胞的氧化应激，导致细胞损 伤直至死亡的重要因素。 本研究拟明确肿瘤细胞中缺氧诱导因子．Iot(HIF．1a)对线粒体氧化呼吸和活 性氧生成的作用，并首次深入揭示HIF．1 C【对FOX0(forkhead transcription Factor)转录因子的调控机制和其他ROS还原剂的作用。通过对上述机制的研 究，评估HIF．1s抑制剂和ROS诱导剂联合治疗胰腺癌的效果。 方法： 一、HIF—la对ROS的清除作用：利用Rotenone阻断线粒体呼吸，终止ROS的产 生，利用流式细胞术检测过表达及干扰HIF一】C【前后，细胞内ROS的含量情 况。细胞采用人胰腺癌细胞MIA PACA一2为研究对象。 二、HIF一10t对FOX01的转录调节研究和ROS还原系统的作用： 1．细胞培养和处理：细胞同上。细胞经DMEM培养基常规传代培养，待细 胞生长至对数生长期时，将细胞收集至六孔板中做不同的处理； 2．Western blot法检测蛋白变化及实时定量PCR法检测mRNA变化：比较 干扰和过表达HIF．1Ⅱ前后FOXOI及下游ROS还原剂蛋白水平和mRNA 的变化； 3．染色体免疫共沉淀(Chip)检测HIF．1 0【与FOX01启动子的HRE直接结合。 天津医科大学硕士学位论文4．双荧光素酶实验：构建FOX01基因启动子荧光素酶表达载体，与HIF．1a 天津医科大学硕士学位论文 4．双荧光素酶实验：构建FOX01基因启动子荧光素酶表达载体，与HIF．1a 过表达载体共转染细胞，观察HIF．1 0【对FOX01基因的转录调节效应。 三、HIF一1Gt抑制剂和ROS诱导剂对胰腺癌细胞的体外药敏作用： 1．MTT法检测药物的IC50及协同效应：检测HIF．1et抑制剂2ME和ROS 诱导剂As203的IC50以及两个药物联合应用时的协同效应最大比例。 2． 细胞凋亡检测：最大协同比例的两种药物处理胰腺癌细胞时的凋亡检测， 利用PI及AnnexinV-FITC染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 3．细胞周期检测：单药及联合用药后细胞周期的变化，75％酒精固定处理 的细胞24h，经PI染色，采用流式细胞仪检测细胞周期。 四、裸鼠体内试验：取四周龄体重相近的雌性裸鼠32只，左下腹部皮下成瘤后 随机分成四组，分别为对照组、2ME组、As203组、2ME和As203合用组， 治疗一个周期，监测老鼠体重、饮食、肿瘤大小变化情况。 结果：在胰腺癌细胞系MIA PACA一2中干扰HIF．1仅的表达后细胞内ROS累积 增多。并且我们发现HIF．1旺的表达与FOX01及其下游相关基因的表达正相关。 我们还发现在HIF．1 c【过表达的细胞中干扰了FOX01的表达后，细胞内仍旧出 现了ROS的累积，说明HIF．1 0【清除ROS确实通过FOXOI及其下游基因来实 现。进一步我们通过CHIP实验证实HIF．1a可与FOX01启动子区的HRE直接 结合，双荧光素酶报告基因也同时验证了FOX01启动子区HRE的功能。在体 外药物实验中，我们发现2ME和As203单独应用均能促进胰腺癌细胞凋亡，且 联合用药时二者具有协同作用，这种协同作用的机制有周期阻滞，细胞内ROS 累积，微管解聚等。在体内药敏实验中，HIF—l 0【抑制剂和ROS诱导剂联合达到 了抗肿瘤的作用。 结论：本研究首次阐述了HIF一1 O【可通过FOX01清除细胞内ROS的累积，采 取HIF一1 c【抑制剂和ROS诱导剂联合应用抗胰腺癌。为胰腺癌的治疗提供一个新 的思路。 关键词：胰腺癌低氧诱导因子．1 FOX01活性氧2甲氧雌二醇三氧化二砷 天津医科大学硕士学位论文Abst