HIV融合蛋白gp41自然突变及功能研究.docx

中国医学科学院北京协和医学院 中国医学科学院北京协和医学院 硕士学位论文 3．5．突变假毒株对第一代和新一代膜融合抑制剂的耐药性检测 ．．32 3．6．点突变后对N肽类抑制剂抗病毒活性的影响 ．34 3．7．CD检测突变点对NHR螺旋稳定性的影响 35 4．讨论 ．．37 5．小结 ．．43 参考文献 ．．45 综述 ．51 一、 摘要 ．51 二、一、 前言月O舌 ．51．51 三、 针对HIV一1 gp41的膜融合抑制剂的抗病毒机制 ．52 四、 N肽类膜融合抑制剂 ．．53 1．源于NHR序列的N肽类膜融合抑制剂 53 2．重组嵌合体N肽类膜融合抑制剂 ．,53 五、 c肽类膜融合抑制剂 一54 1．源于CHR序列的C肽类膜融合抑制剂 ,54 2．改造的C肽类膜融合抑制剂 ．55 六、 总结 一58 附录 ．63 致谢 ．69 个人简历 ．．71 万方数据 中国医学科学院北京协和医学院 中国医学科学院北京协和医学院 硕士学位论文 图表 表1：HIV一1蛋白序列数据库中HIV一1和SlVcpz Env gp41蛋白第49位点氨基酸 突变频率的统计。 表2：HIV蛋白序列数据库中Env gp41蛋白第57位点氨基酸突变频率的统计。 表3：HIV．1突变株对短肽类膜融合抑制剂的耐药性。 表4：HIV一1突变株对第一代和新一代膜融合抑制剂的耐药情况。 表5：E49和L57位点系列突变株突变频率、感染能力、耐药性、螺旋稳定性 的比较汇总。 图1：HIV．1 gp41蛋白结构域示意图及多肽类膜融合抑制剂序歹aj[671。 图2：单个位点氨基酸突变对包膜蛋白表达情况的影响。 图3：HIV一1NL4．3突变假病毒株单次入侵TZM细胞相对感染能力的比较。 图4：突变株对三种短肽类药物耐药倍数的散点图。 图5：长肽类抑制剂对突变株抑制效果散点图。 图6：多肽N36及其单点突变多肽对HIVNL4—3假病毒抑制率。 图7：E49位置上单个氨基酸突变对NHR螺旋形成比例和螺旋热稳定性的影响。 图8：L57位点的氨基酸突变对NHR螺旋比例及NHR螺旋热稳定性的影响。 图9：E49和L57在6-HB中的位置示意图及多肽覆盖区域意图。 万方数据 中国医学科学院北京协和医学院 硕士学位论文 4 万方数据 中国医学科学院北京协和医学院 中国医学科学院北京协和医学院 硕士学位论文 HIV-1融合蛋白gp41自然突变及功能研究 摘要 HIV包膜蛋白(Env)在病毒入侵过程中起着关键的作用：介导受体结合和膜融 合。研究表明，6一HB的形成是HIV膜融合的关键所在，而来自于NHR和CHR的多 肽可以阻断病毒6．HB的形成，是理想的药物靶点。基于我们在gp41上发现的新结 构M．T钩子，我们以模板SC22EK设计了短小多肽MT—SC22，其具有极高的Na zJ活 性，并且有很高的耐药基因屏障。前期我们用模板短肽SC22EK及具有高抑制活性 的MT—SC22筛选出在gp41保守序列上发生剧烈的氨基酸突变的两个氨基酸位点 (Glu49、Leu57)，分别简称为E49K、L57R。 本研究对HIV database Env序列进行了分析，发现在E49位点上出现由E突变 为A、D、G、K、N、Q、s共七种自然突变；在L57位点上共出现由L突变为F、P、 R、V四种自然突变。为了更全面地研究L57氨基酸位点的功能，本研究另外加入了 L57A突变，一共12组氨基酸突变。本课题以表达HIV一1毒株NL4—3囊膜蛋白(Env) 的质粒作为模板进行定点突变，成功获得了12个系列突变质粒。经Western Blot 和capture ELISA检测证实这些突变不影响Env的表达和切割；紧接着我们分析了突 变对病毒入侵靶细胞能力以及膜融合抑制剂抗病毒活性的影响，发现多个自然突变 能够显著影响HIV一1的入侵能力，并介导对抑制剂的高度耐药；同时以NHR多肽 N36为模板合成含有以上12种氨基酸突变的系列多肽，比较分析了N36、N36E49-X、 N36。5，．。对NL4．3假病毒株的抑制活性以及多肽自身螺旋稳定性，结果显示突变后的 氨基酸对NHR螺旋稳定性、NHR螺旋三聚体与CHR亲和性都有一定影响。我们从 突变点对病毒囊膜蛋白功能、NHR稳定性、6一HB稳定性和抑axJN亲和力四个主要方 面，深入探讨了HIV一1膜融合抑制剂的耐药机制。 综合多方面的研究结果，本研究得出以下结论：(1)E49和L57的突变毒株对 短肽抑制剂(如SC22、HP23等)有较强的拮抗作用，而对长肽类抑制剂(如T20、 SFT)的作用效果不明显；(2)病毒突变的氨基酸与CHR或抑制剂上相应的氨基酸 之间的电荷相互作用可以影响抑制剂的效率：另一方面，突变点可以影响病毒与抑 制