HnNP L在膀胱癌发生发展中的功能和分子机制研究.docx

硕士学位论文caspase．9a前体mRNA优先结合，导致其降解，进而影II向caspase．9 硕士学位论文 caspase．9a前体mRNA优先结合，导致其降解，进而影II向caspase．9 mRNA亚型的 表达，最终调控非小细胞肺癌发生；在肝癌细胞中干扰hnRNP L的表达后，肿瘤 细胞增殖、迁移能力显著减低。HnRNP L参与众多肿瘤生物学行为的调节，然而 迄今为止尚未有hnRNP L参与膀胱癌的生物学进程的文献报道。我们前期工作中 通过膀胱癌组织芯片的免疫组化检测发现hnRNP L在膀胱癌组织中表达上调，其 高表达与膀胱癌进程有密切联系。然而，目前hnRNP L在膀胱癌中的发生发展及 转移中的是否也发挥同样的功能至今仍不清楚，hnRNP L在膀胱癌中高表达，其 可能的调控机制亦知之甚少。 本课题拟检测hnRNP L在膀胱癌中的表达情况，分析其表达与患者相关临 床病理参数之间的关系；通过体内外实验对hnRNP L在膀胱癌增殖、凋亡及侵 袭转移中的功能进行研究；同时探究hnRNP L在膀胱癌中异常高表达可能的下 游作用机制。 本研究的开展有助于为膀胱癌生长和转移机制提供新的实验依据及思路； 最终可为膀胱癌临床早期诊断、治疗及预后判断提供可靠的新型分子标志物。 研究方法： (1)HnRNP L在膀胱癌组织及细胞中的表达 采用蛋白免疫印迹(Western blot)和荧光光定量PCR检测hnRNP L在膀胱 癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达，检测hnRNP L在正常膀胱移行上皮细胞 SV-HUC．1及膀胱癌细胞UM．UC．3、EJ、T24、5637中的表达； (2)HnRNP L在膀胱癌组织表达及其与患者临床参数之间相关性 应用免疫组化(IHC)检测膀胱癌石蜡样本中hnRNP L的表达，并分析hnRNP L的表达与肿瘤的分化、分期和临床预后等相关病理参数之间的关系； (3)HnRNP L在膀胱癌中的生物学功能 建立hnRNP L稳定干扰和过表达的膀胱癌细胞株，通过CCK．8、平板克隆 形成实验和裸鼠皮下成瘤检测细胞增殖改变情况，利用Transwell实验及划痕愈 III 万方数据 摘要合实验检测细胞侵袭迁移能力变化，通过流式细胞技术检测细胞周期分布及细 摘要 合实验检测细胞侵袭迁移能力变化，通过流式细胞技术检测细胞周期分布及细 胞凋亡的改变； (4)HnRNP L在膀胱癌进展过程中的作用机制 运用Westem blot凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-9、Bcl-2、 Bcl2L1、PARPl的改变以及MAPK信号通路(p-ERKl／2、p-P38、p-JNK)及 Nrf2、E2F1的激活情况。利用荧光定量PCR和Western blot检测hnRNP L稳定 敲低和过表达后EMT标志物(E．cadherin、Vimentin、Claudin．1、ZO．1、13-catenin、 ZEBl、snail)的变化。 结果： (1)膀胱癌组织中hnRNP L蛋白的表达水平检测 IHC结果显示hnRNP L蛋白阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色， 在74．2％(115／155)的膀胱癌患者中呈阳性表达，正常膀胱组织hnRNPL蛋白表 达阳性率低于其配对肿瘤组织；Western blot矛I]qRT-PCR结果显示膀胱癌组织中的 hnRNP L蛋白及mRNA表达水平高于其配对的正常膀胱组织； (2)HnRNP L蛋白表达和临床病理参数的关系 在膀胱癌组织中，hnRNP L蛋白表达与年龄、TNM分期、临床病理分级及 组织学分级明显相关(尸0．05)，而与患者的性别无明显相关(尸0．05)； Kaplan．Meier法分析显示hnRNP L高表达组膀胱癌患者的5年生存率要显著低 于低表达组，差异具有统计学意义(Log rank，P0．05)；多因素Cox风险比例 模型分析显示：hnRNP L是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(尸=D．001)； (3)HnRNP L表达对膀胱癌细胞生物学功能的影响 3．1 HnRNP L稳定干扰和过表达的膀胱癌细胞株构建 Western blot验证结果表明慢病毒表达载体转染后，成功构建了hnIⅢP L稳定 干扰和过表达的膀胱癌细胞株： IV 万方数据 硕士学位论文3．2 硕士学位论文 3．2 HnRNP L稳定干扰和过表达对膀胱癌细胞增殖能力的影响 CCK．8结果显示：与对照组相比，hnRNP L稳定干扰组的细胞生长速度显著 下降(尸O．05)，而过表达组细胞生长速度显著快于对照组(尸0．05)；平板克 隆形成实验结果显示：与对照组相比，hnRNP L稳定干扰组形成的克隆数量显著 减少(PO．05)，而过表达组形成的克隆数量显著增加(尸O．0